Porównanie różnych technik mikroskopii superrozdzielczej
W przypadku konwencjonalnej mikroskopii świetlnej dyfrakcja światła ogranicza rozdzielczość obrazowania do około 250 nm. Obecnie techniki superrozdzielczości mogą poprawić ten wynik ponad 10-krotnie. Technikę tę uzyskuje się głównie za pomocą trzech metod: mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczych cząsteczek, w tym fotoczułej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) i stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM); mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (SIM); i stymulowanej mikroskopii zubożenia emisji (STED). To, jak wybrać technologię super rozdzielczości, jest tym, na czym wszystkim zależy. "Niestety, nie ma prostych zasad decydujących o tym, którą metodę zastosować" - mówi Mathew Stracy, doktor habilitowany na Uniwersytecie Oksfordzkim w Wielkiej Brytanii. „Każdy ma swoje zalety i wady”. Naukowcy zastanawiają się oczywiście również, jak wybrać odpowiednią metodę do konkretnego projektu. „W kontekście bioobrazowania kluczowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę, to: rozdzielczość przestrzenna i czasowa, wrażliwość na fotouszkodzenia, zdolność znakowania, grubość próbki oraz fluorescencja tła lub autologiczna fluorescencja komórki”. Jak to działa Różne mikroskopy superrozdzielcze działają na różne sposoby. W przypadku PALM i STORM tylko niewielka część znaczników fluorescencyjnych jest wzbudzana lub fotoaktywowana w danym momencie, co umożliwia ich samodzielną lokalizację z dużą precyzją. Przejście przez ten proces ze wszystkimi etykietami fluorescencyjnymi daje pełny obraz o super rozdzielczości. Stefan Hell, jeden z laureatów Nagrody Nobla w dziedzinie chemii z 2014 roku i dyrektor Instytutu Chemii Biofizycznej im. Maxa Plancka, powiedział: „System PALM/STORM jest stosunkowo łatwy w konfiguracji, ale trudny do zastosowania, ponieważ grupa musi mieć zdolność fotoaktywacji. Ograniczenia Wadą jest to, że muszą wykryć pojedynczą cząsteczkę fluorescencyjną w kontekście komórki i są mniej niezawodne niż STED. STED wykorzystuje impuls laserowy do wzbudzenia fluoroforu i lasera w kształcie pierścienia do wygaszenia fluoroforu, pozostawiając jedynie pośrednią fluorescencję o wielkości nanometra dla superrozdzielczości. Zeskanowanie całej próbki daje obraz. „Zaletą STED jest to, że jest to technologia przycisku” – wyjaśnił Hell. „Działa jak standardowy konfokalny mikroskop fluorescencyjny”. Może również obrazować żywe komórki za pomocą fluoroforów, takich jak zielone lub żółte białka fluorescencyjne i barwniki pochodzące z rodaminy. Porównanie parametryczne Chociaż wszystkie techniki superrozdzielczości przewyższają konwencjonalną mikroskopię świetlną pod względem rozdzielczości, różnią się one od siebie. SIM z grubsza podwaja rozdzielczość do około 100 nm. PALM i STORM mogą rozwiązywać cele 15 nm. Według Hell, STED zapewnia rozdzielczość przestrzenną 30 nm w żywych komórkach i 15 nm w nieruchomych komórkach. Jeśli chodzi o konkretne zastosowania, musimy również wziąć pod uwagę stosunek sygnału do szumu. W niektórych przypadkach niższa rozdzielczość, ale wyższy SNR może skutkować lepszym obrazem niż odwrotnie (wyższa rozdzielczość, ale niższy SNR). Bardzo ważna jest również szybkość pozyskiwania obrazu, szczególnie w przypadku żywych komórek. „Wszystkie techniki superrozdzielczości są wolniejsze niż konwencjonalne techniki obrazowania fluorescencyjnego” – powiedział Stracy. „PALM/STORM jest najwolniejszy, potrzebuje dziesiątek tysięcy klatek, aby uzyskać pojedynczy obraz, SIM potrzebuje dziesiątek klatek, a STED to technologia skanowania, więc szybkość akwizycji zależy od wielkości pola widzenia”. Oprócz żywych komórek lub stałych komórek obrazowania, niektórzy naukowcy chcą również zrozumieć, w jaki sposób poruszają się obiekty. Stracy jest zainteresowany zrozumieniem dynamiki systemów biologicznych w żywych komórkach, a nie tylko statycznymi obrazami. Łączy PALM ze śledzeniem pojedynczych cząstek, aby analizować dynamikę żywych komórek. W ten sposób może bezpośrednio śledzić molekuły znacznikowe w trakcie wykonywania przez nie swoich funkcji. Uważa jednak, że SIM nie nadaje się do badania tych dynamicznych procesów na poziomie molekularnym, ale ze względu na dużą szybkość akwizycji szczególnie nadaje się do obserwacji dynamiki większych struktur, takich jak całe chromosomy. Najnowsze wyniki W 2017 roku zespół Hell's poinformował o super-rozdzielczym mikroskopie MINFLUX w Science. Według Hell, ta metoda super-rozdzielczości po raz pierwszy osiąga rozdzielczość przestrzenną 1 nm. Ponadto może śledzić poszczególne cząsteczki w żywych komórkach co najmniej 100 razy szybciej niż inne metody. Inni naukowcy również bardzo dobrze wypowiadali się o mikroskopie MINFLUX. „Ciągle opracowywane są nowe zastosowania i podejścia, ale dla mnie wyróżniają się dwa postępy” — powiedział Shechtman. Jednym z nich jest MINFLUX. „Wykorzystuje genialne podejście, aby uzyskać bardzo precyzyjne pozycjonowanie molekularne”. Jeśli chodzi o drugi ekscytujący rozwój, Shechtman wspomniał o WE Moerner i jego współpracownikach z Uniwersytetu Stanforda. Moerner był także laureatem Nagrody Nobla w dziedzinie chemii w 2014 roku. Jeden ze zwycięzców. Aby zająć się ograniczeniem rozdzielczości obrazowania spowodowanym anizotropowym rozpraszaniem pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych, naukowcy wykorzystali różne polaryzacje wzbudzenia, aby określić orientację i położenie cząsteczek. Ponadto opracowali delikatne powierzchnie źrenic. Techniki te poprawiają zdolność lokalizowania struktur. Informacje o etykietach fluorescencyjnych W wielu zastosowaniach z superrozdzielczością etykiety naprawdę mają znaczenie. Istnieją również firmy, które dostarczają powiązane produkty. Na przykład niemiecka firma Miltenyi nawiązała współpracę z Abberior, firmą założoną przez Stefana Hella, aby świadczyć niestandardowe usługi koniugacji przeciwciał dla barwników mikroskopowych o super rozdzielczości. Wiele innych firm oferuje również pasujące znaczniki. „Nasze nano-wzmacniacze są bardzo małe, zaledwie 1,5 kDa i bardzo specyficzne” — mówi Christoph Eckert, specjalista ds. marketingu w firmie ChromoTek. Białka te wiążą zielone i czerwone białka fluorescencyjne (GFP i RFP). Pochodzą one z fragmentów przeciwciał alpaki, znanych jako VHH lub nanociała, o doskonałych właściwościach wiązania i stabilnej jakości bez różnic między partiami. Markery te są odpowiednie dla różnych technik super rozdzielczości, w tym SIM, PALM, STORM i STED. Ai-Hui Tang, adiunkt na University of Maryland School of Medicine, wraz ze współpracownikami wykorzystał GFP-Booster i STORM firmy ChromoTek do zbadania propagacji informacji w układzie nerwowym. Odkryli nanoklastry molekularne, zwane nanokolumnami, w neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Naukowcy uważają, że ta struktura pokazuje, że ośrodkowy układ nerwowy wykorzystuje proste zasady do utrzymania i regulacji wydajności synaptycznej. Różne wersje obrazowania w super rozdzielczości i rosnąca liczba metod wciągają naukowców jeszcze głębiej w biologiczne tajemnice. Przekraczając granicę dyfrakcji światła widzialnego, biolodzy mogą nawet „ściśle monitorować” działania komórek.
