Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji
TIRFM (ang. Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), mikroskop fluorescencyjny całkowitego wewnętrznego odbicia, gdy światło wpada do ośrodka o niższym współczynniku załamania z ośrodka o wysokim współczynniku załamania światła, jeśli kąt padania jest wystarczająco duży, całe światło zostaje odbite bez załamania, ale w Interfejs dwóch mediów wytwarza zanikające fale, które mogą wzbudzić fluorescencję w odległości 100 nm w pobliżu interfejsu, aby zrealizować obserwację powierzchni obiektu. Światło wzbudzenia może być przesyłane przez oświetlacz konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego lub specjalny oświetlacz, a kąt padania lasera może być kontrolowany. Metoda chwilowego wzbudzenia pola służy do zapobiegania przedostawaniu się światła wzbudzenia do detektora. Światło wzbudzenia na styku szkła i wody wytwarza pełne odbicie wewnętrzne. Ze względu na wykładnicze tłumienie światła wzbudzającego, tylko obszar próbki bardzo blisko całkowitej powierzchni odbicia wytworzy odbicie fluorescencyjne, co znacznie zmniejsza interferencję szumu światła tła z celem obserwacji, więc ta technologia jest szeroko stosowana w dynamicznych obserwacjach substancji powierzchniowych komórek.
Schemat ideowy mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM)
①Próbka ②Zakres fal zanikających ③Szkło nakrywkowe ④Zanurzenie w olejku ⑤cel ⑥wiązka emisyjna (sygnał) ⑦wiązka wzbudzająca
Aby osiągnąć całkowite wewnętrzne odbicie, wymagany jest duży kąt padania, na przykład kąt padania na granicy faz szkło-woda jest większy niż 61 stopni. Można to osiągnąć za pomocą pryzmatu, zwanego TIRFM opartym na pryzmacie, lub soczewki obiektywu o dużej aperturze numerycznej, zwanej obiektywnym TIRFM. Obecnie dostępne na rynku mikroskopy fluorescencyjne z całkowitym wewnętrznym odbiciem są na ogół typu obiektywu, z dużą szybkością i wysoką precyzją.
Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia jest szeroko stosowana w niektórych dziedzinach biologii, ponieważ umożliwia obserwację fluorescencji w bardzo wąskim zakresie (poniżej 100 nm) na powierzchni obiektów. Takich jak następujące aplikacje:
Obserwacja obrazów powierzchni komórki: struktura powierzchni błony komórkowej, kontakt powierzchni komórki, dynamika powierzchni błony/lokalizacja białek.
Obserwacja i manipulacja pojedynczymi cząsteczkami: miozyna, aktyna i ATP znakowane Cy3-.
Ruch powierzchni błony komórkowej: taki jak pochłanianie pęcherzyków, wydychanie pęcherzyków i zewnątrzwydzielniczy pęcherzyk. the
Obserwacja zjawiska iskrzenia wapnia w błonie komórkowej, monitorowanie kanałów jonowych.
Badania motoryki molekularnej: silniki rotacyjne, białka cytoszkieletu, polimery, białka G, białka pierścieniowe, motory nukleotydowe.
Oprócz dziedziny biologii ma również dobre zastosowania w dziedzinie chemii do obserwacji chemicznych struktur molekularnych.
