Zastosowanie nowoczesnej koncepcji mikroskopu w obserwacji świata mikroskopowego
Od czasów starożytnych do współczesności istoty ludzkie dążyły do wyższych i dalszych prawd. Od podróży oceanicznych po eksplorację kosmosu, ludzie jeden po drugim osiągali wielkie cele. Jednak makroskopowy świat, który ludzie widzą gołym okiem, nie jest całym światem, a ludzkie oko nie widzi go wyraźnie. Przyciąga również niezliczone osoby do odkrywania i ścigania.
Niezależnie od rzeczy makroskopowych czy mikroskopowych, nasze obserwacje opierają się na atrybutach przestrzeni trójwymiarowej, czyli trójwymiarowej XYZ, a obserwacja zmian kształtu rzeczy wymaga wprowadzenia kolejnego czynnika pomiarowego – czasu T, a więc najbardziej kompletnym sposobem obserwowania rzeczy musi być Jednoczesne rejestrowanie XYZT, czyli długoterminowe fotografowanie kształtu i czasu, jest również ostateczną funkcją mikroskopu.
Po ponad 300 latach rozwoju nowoczesne mikroskopy zaproponowały koncepcje, takie jak rozdzielczość, głębia ostrości i pole widzenia, i stale proponowały rozwiązania. Mikroskopy początkowo zaspokajały nasze potrzeby w zakresie obserwacji mikroskopijnego świata i pomogły nam rejestrować przestrzeń i czas mikroskopijnego świata.
Najważniejszą rzeczą w mikroskopowej obserwacji świata jest rozdzielczość szczegółów i z tego narodziła się koncepcja rozdzielczości. Rozdzielczość odnosi się do minimalnej odległości między dwoma punktami, którą może rozróżnić ludzkie oko, i obowiązuje tylko w wymiarze XY. Zgodnie z kryterium Rayleigha, kryterium Rayleigha, granica, którą normalni ludzie mogą rozróżnić, to dwa punkty 0,2 mm w odległości 25 cm. Kiedy używamy mikroskopu, możemy zobaczyć dwa punkty w mniejszej odległości, co poprawia rozdzielczość naszej obserwacji. Wraz z ciągłym pogłębianiem się nowoczesnych badań, wymagania ludzi dotyczące rozdzielczości również stale rosną, a naukowcy stale poprawiają również rozdzielczość mikroskopów. Na przykład mikroskopy elektronowe zwiększyły rozdzielczość do poziomu nanometrów, umożliwiając obserwację wirusów. Ultra-wysoka technologia obrazowania mikroskopowego poprawia rozdzielczość mikroskopu z 200 nanometrów do dziesiątek nanometrów, realizując obserwację żywych organelli komórkowych.
Poprawa rozdzielczości niesie ze sobą także nowe problemy, czyli zmniejszenie pola widzenia i głębi ostrości. Przy użyciu zwykłej metody oświetlenia centralnego (metody oświetlenia fotopowego, która sprawia, że światło przechodzi równomiernie przez preparat), odległość rozdzielczości mikroskopu wynosi d=0,61 λ/NA, zakres długości fal światła widzialnego wynosi { {2}}nm, średnia długość fali wynosi 550 nm, a długość fali jest stałą. Dlatego zwiększenie wartości NA może uzyskać mniejszą wartość D, to znaczy odległość między dwoma punktami, które można rozróżnić jako Mniejsze, co pozwala ludziom wyraźnie widzieć mniejsze obiekty.
Wartość NA to apertura numeryczna, która opisuje wielkość kąta stożka odbierającego światło soczewki, NA=n * sin , czyli iloczyn współczynnika załamania światła (n) ośrodka między soczewką a badany obiekt i sinus połowy kąta rozwarcia (2 ). n jest współczynnikiem załamania światła ośrodka między soczewką obiektywu a próbką. Gdy ośrodkiem przestrzeni obiektu mikroskopu jest powietrze, współczynnik załamania światła n=1. Użycie ośrodka o wyższym współczynniku załamania światła niż powietrze może znacznie zwiększyć wartość NA. Medium zanurzeniowym w wodzie jest woda destylowana, a współczynnik załamania światła Stosunek wynosi 1,33; obiektywem zanurzeniowym w oleju jest olejek cedrowy lub inne przezroczyste oleje, a jego współczynnik załamania światła wynosi na ogół około 1,52, co jest zbliżone do współczynnika załamania światła soczewki i szkiełka slajdów. Dlatego wartość NA soczewki olejowej jest wyższa niż soczewki powietrznej.
Kąt apertury, znany również jako „kąt ust lustrzanych”, to kąt utworzony przez punkt obiektu na osi optycznej obiektywu i efektywną średnicę przedniej soczewki obiektywu. Zwiększenie kąta ust lustra może zwiększyć wartość sinusoidalną, a jej rzeczywista górna granica wynosi około 72 stopni (wartość sinusoidalna to 0},95), pomnożona przez współczynnik załamania światła olejku cedrowego 1,52, można uzyskać, że maksymalna wartość NA wynosi około 1,45 i podstawiona do wzoru na obliczenie rozdzielczości, można otrzymać, że graniczna rozdzielczość płaszczyzny XY konwencjonalnego mikroskopu wynosi około 0,2 um.
Wartość NA wpływa również bezpośrednio na jasność pola widzenia mikroskopu (B). Ze wzoru B∝NA2/M2 możemy wywnioskować, że jasność wzrasta wraz ze wzrostem apertury numerycznej (NA) lub zmniejszeniem powiększenia obiektywu (M).
Teoretycznie powinniśmy dążyć do jak największej wartości NA, aby uzyskać lepszą rozdzielczość płaszczyzny XY i jasność pola widzenia. Jednak wszystko ma dwie strony. Poprawa rozdzielczości płaszczyzny XY zmniejszy głębię ostrości osi Z i pole widzenia obserwacji.
Mikroskopy generalnie oglądają widok pionowo w dół. Kiedy położenie wypukłe i położenie wklęsłe na powierzchni przedmiotu obserwowane w obrębie średnicy pola widzenia są wyraźnie widoczne, wówczas różnica wysokości między punktem wypukłym a punktem wklęsłym jest głębią ostrości. Cóż, w przypadku mikroskopów im większa głębia ostrości, tym lepiej. Im większa głębia ostrości, tym lepsze i bardziej trójwymiarowe obrazy można uzyskać podczas obserwacji powierzchni nierównych obiektów. Duża głębia ostrości pozwala nam obserwować mikroskopijny świat w pionie. To znaczy informacje o osi Z w trójwymiarowej formie XYZ.
Głębia ostrości to głębia przedniej i tylnej przestrzeni odpowiadająca wyraźnemu obrazowi na płaszczyźnie obrazu: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: głębia ostrości , NA: apertura numeryczna, M: całkowite powiększenie, λ: długość fali światła, (zwykle λ=0,55um), n: współczynnik załamania ośrodka między próbką a soczewką obiektywu (powietrze: n{{3 }}, oil: n=1.52) Zgodnie z tym wzorem możemy wiedzieć, że głębia ostrości osi Z jest odwrotnie proporcjonalna do wartości NA płaszczyzny XY.
Oprócz głębi ostrości na pole widzenia wpływa również wartość NA. Zakres przestrzenny, który można zobaczyć, gdy instrument nieruchomo patrzy na punkt, to pole widzenia. Jego obliczenie jest bezpośrednio związane z powiększeniem obiektywu. Rzeczywista średnica pola widzenia obserwowanego przez obserwację jest równa średnicy pola widzenia Podzielona przez powiększenie obiektywu, okular wskaże odpowiednie pole widzenia, takie jak 10/18, czyli powiększenie wynosi 10 razy, a średnica pola widzenia to 18mm. Dlatego przy określaniu okularu im większe powiększenie, tym mniejsze obserwowane pole widzenia.
Rozdzielczość płaszczyzny XY to analiza lokalnych szczegółów, a pole widzenia określa nasz zasięg obserwacji próbki. Im większe pole widzenia, tym lepiej, ale ograniczone przez obecną technologię, musimy używać obiektywów o dużej mocy, aby uzyskać dobre wartości NA, dlatego pole widzenia i wartości NA mają pośrednią korelację ujemną.
