Podstawowa struktura konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
(1) Moduł skanujący
Moduł skanujący składa się głównie z listwy świetlnej z otworkami (kontrolującej grubość warstw optycznych), spektroskopu (zmieniającego kierunek propagacji światła w zależności od długości fali), kolorymetru emisyjnego fluorescencji (wybierając do detekcji światło w określonym zakresie długości fal) oraz detektor (fotopowielacz). Mieszana fluorescencja w próbce fluorescencyjnej wchodzi do skanera i po wybraniu przez pasek świetlny z otworkami do wykrywania, spektrometr i kolorymetr, jest dzielona na różne fluorescencje monochromatyczne, które są wykrywane w różnych kanałach fluorescencji i tworzą odpowiednie obrazy konfokalne. Jednocześnie na ekranie komputera można wyświetlić kilka równoległych monochromatycznych obrazów fluorescencyjnych i ich złożone obrazy.
(2) System mikroskopii fluorescencyjnej
Mikroskop jest głównym elementem LSCM, który jest powiązany z jakością obrazowania systemu. Ścieżkę optyczną mikroskopu można łatwo wstawić do nieskończenie odległego układu optycznego z opcjami optycznymi, bez wpływu na jakość obrazowania i dokładność pomiaru. Obiektywem powinien być obiektyw apochromatyczny z dużą aperturą numeryczną i płaskim polem, co jest korzystne dla akwizycji fluorescencji i wyraźnego obrazowania. Konwersja grupy soczewek obiektywowych, dobór grupy filtrów barwnych, regulacja ruchu stolika i blokowanie pamięci płaszczyzny ogniskowej powinny być automatycznie kontrolowane przez komputer.
Mikroskop fluorescencyjny stosowany w laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej jest zasadniczo taki sam, jak konwencjonalny mikroskop fluorescencyjny, ma jednak swoją własną charakterystykę: musi być podłączony do skanera, aby laser mógł dostać się do obiektywu mikroskopu w celu napromieniowania próbki i fluorescencja emitowana przez próbkę dociera do detektora; Wymagane jest urządzenie do konwersji ścieżki światła, które przekształca lampy rtęciowe w lasery i umożliwia regulację natężenia światła lampy rtęciowej.
(3) Powszechne lasery
Źródła laserowe stosowane w skaningowej mikroskopii konfokalnej obejmują systemy jedno- i wielolaserowe, a powszechnie stosowane lasery obejmują trzy następujące typy:
Laser półprzewodnikowy: 405 nm (linia widmowa bliskiego ultrafioletu)
Laser jonowy argonu: 457 nm, 477 nm, 488 nm, 514 nm (niebieskie, zielone światło)
Laser He-Ne: 543 nm (zielone światło zielonego lasera He-Ne) 633 nm (czerwone światło czerwonego lasera He-Ne)
Laser UV (laser UV): 351 nm, 364 nm (światło UV)
(4) Sprzęt pomocniczy
Chłodzone powietrzem, chłodzone wodą systemy chłodzenia i regulowane zasilacze.
Podstawową zasadą działania laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego jest najpierw wyemitowanie z lasera światła wzbudzającego o określonej długości fali. Po wzmocnieniu światło przechodzi przez oświetlony pasek świetlny z otworkami w skanerze, tworząc punktowe źródło światła. Soczewka obiektywu skupia się na płaszczyźnie ogniskowej próbki, a odpowiednie oświetlone punkty na próbce są wzbudzane i emitują fluorescencję. Po przejściu przez pasek świetlny otworu detekcyjnego dociera do detektora i jest obrazowany na ekranie monitorującym komputer. W ten sposób z obrazów fluorescencyjnych każdego punktu próbki na płaszczyźnie ogniskowej tworzony jest pełny obraz konfokalny, co nazywa się plasterkiem światła.
