Oznaczanie liczby mikroorganizmów - bezpośrednia metoda liczenia pod mikroskopem!
Wzrost populacji bakterii objawia się wzrostem liczby komórek lub wzrostem masy komórkowej. Sposoby określania liczby komórek obejmują metodę bezpośredniego zliczania pod mikroskopem, metodę zliczania kolonii na płytce, metodę proporcji oleju fotoelektrycznego, metodę największego prawdopodobieństwa i metodę filtracji membranowej. Metody pomiaru materii komórkowej obejmują oznaczanie suchej masy komórek, oznaczanie niektórych składników komórkowych, takich jak zawartość azotu, RNA i DNA oraz oznaczanie metabolitów. Krótko mówiąc, istnieje wiele metod pomiaru wzrostu mikroorganizmów, z których każda ma swoje zalety i wady i należy je wybierać w zależności od konkretnej sytuacji. Eksperyment ten wprowadza głównie mikroskopową metodę bezpośredniego liczenia, powszechnie stosowaną w produkcji i badaniach naukowych.
1. Cel Wymagania
1. Wyjaśnij zasadę morfologii krwi.
2. Opanuj metodę liczenia mikroorganizmów za pomocą licznika krwinek.
2. Podstawowe zasady
Mikroskopowa metoda liczenia bezpośredniego to prosta, szybka i intuicyjna metoda bezpośredniego zliczania niewielkiej ilości zawiesiny badanej próbki na specjalnym szklanym szkiełku o określonej powierzchni i objętości (zwanym także licznikiem bakterii). Metody. Obecnie powszechnie stosowanymi licznikami bakterii w kraju i za granicą są: tablica do liczenia krwinek, licznik bakterii Peteroff-Hauser, licznik bakterii Hawksley itp. Można je stosować do liczenia drożdży, bakterii, zarodników pleśni i innych zawiesin oraz podstawowa zasada jest taka sama. Dwa ostatnie typy liczników bakterii mają całkowitą objętość 0.{4}}2mm3 po nakryciu szkiełkiem nakrywkowym, a odległość między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem wynosi zaledwie 0,02mm, więc olej Obiektyw zanurzeniowy może być używany do obserwacji i obserwowania małych komórek, takich jak bakterie. liczyć. Oprócz tych bakteriometrów istnieje również metoda szacowania stosunku pola powierzchni rozmazu do pola widzenia obserwowanego bezpośrednio pod mikroskopem, która jest powszechnie stosowana do badań bakteriologicznych mleka. Zaletą mikroskopowej metody liczenia bezpośredniego jest intuicyjność, szybkość i łatwość obsługi. Wadą tej metody jest jednak to, że zmierzony wynik jest zazwyczaj sumą komórek martwych i żywych. Obecnie istnieją pewne metody przezwyciężenia tego niedociągnięcia, takie jak połączenie żywych bakterii barwiących hodowlę mikrokomorową (krótki czas) i dodanie inhibitorów podziału komórkowego w celu osiągnięcia celu zliczania tylko żywych bakterii.
W tym eksperymencie hemocytometr wykorzystano jako przykład do bezpośredniego zliczania mikroskopowego. W przypadku korzystania z pozostałych dwóch rodzajów liczników bakterii należy zapoznać się z instrukcjami każdego producenta. Liczenie bezpośrednio pod mikroskopem za pomocą hemocytometru jest powszechnie stosowaną metodą liczenia mikroorganizmów. Płytka licząca to specjalna szklana ślizgawka, na której cztery platformy tworzą trzy platformy; szersza platforma pośrodku jest podzielona na dwie połowy krótką poprzeczną szczeliną, a po obu stronach platformy znajduje się siatka. Każda siatka jest podzielona na dziewięć dużych kwadratów, a duży kwadrat pośrodku to pomieszczenie do liczenia. Strukturę płytki do liczenia krwinek przedstawiono na rycinie 1{{{{10}}}}. Skala pokoju liczenia ma zazwyczaj dwie specyfikacje, jedna to duży kwadrat podzielony na 25 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 16 małych kwadratów (Rysunek 15-2); drugi to duży kwadrat. Kwadrat jest podzielony na 16 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 25 małych kwadratów, ale bez względu na rodzaj tablicy do liczenia, w każdym dużym kwadracie jest 400 małych kwadratów. Długość boku każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm, a pole każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2. Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym wysokość między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym wynosi 0,1 mm, a więc objętość komory zliczeniowej wynosi 0,1 mm3 (jedna tysięczna mililitra). Rycina 15-1 Budowa tablicy do liczenia krwinek (1) Rycina 15-2 Budowa tablicy do liczenia krwinek (2) A. Widok z przodu; B. Przekrój podłużny; Powiększona siatka, duży kwadrat pośrodku to komora zliczająca 1. Komórki krwi Płytka do zliczania; 2. Szkło nakrywkowe; 3. Podczas liczenia w komorze zliczającej należy zazwyczaj policzyć całkowitą liczbę bakterii w pięciu kwadratach, następnie obliczyć średnią z każdego kwadratu i pomnożyć przez 25 lub 16, aby uzyskać całkowitą liczbę bakterii w dużym kwadracie, a następnie przeliczyć na całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego. Niech całkowita liczba bakterii w pięciu kwadratach będzie równa A, a stosunek rozcieńczenia roztworu bakteryjnego jako B. Jeśli jest to płytka licząca z 25 kwadratami, całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(sztuk) Podobnie, jeśli jest to płytka licząca z 16 średnimi kwadratami, całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego=A/ 5×16×104×B=32000AB·B (sztuk)
3. Wyposażenie
1. Bakterie
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenty lub inne przybory
Hemocytometr, mikroskop, szkiełko nakrywkowe, sterylny zakraplacz kapilarny.
4. Kroki obsługi
1. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
Saccharomyces cerevisiae przygotowano w postaci zawiesiny bakteryjnej o odpowiednim stężeniu ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
2. Gabinet liczenia mikroskopów
Przed dodaniem próbek obejrzyj mikroskopowo komorę zliczeniową płytki zliczającej. Jeśli jest brud, należy go wyczyścić i wysuszyć przed liczeniem.
3. Dodaj próbkę
Przykryj czysty i suchy hemocytometr szkiełkiem nakrywkowym, a następnie sterylnym zakraplaczem kapilarnym upuść małą kroplę wstrząśniętej zawiesiny Saccharomyces cerevisiae z krawędzi szkiełka nakrywkowego i pozwól, aby roztwór bakteryjny automatycznie przesunął się wzdłuż szczeliny w wyniku osmozy kapilarnej. Wchodząc do liczarni ogólnej można napełnić płynem bakteryjnym. Podczas pobierania próbek najpierw wstrząśnij roztworem bakteryjnym; podczas dodawania próbek w komorze zliczającej nie powinny powstawać pęcherzyki powietrza.
4. Liczenie mikroskopowe
Po dodaniu próbki odstaw na 5 minut, następnie umieść hemocytometr na stoliku mikroskopowym, najpierw znajdź lokalizację komory zliczającej za pomocą mikroskopu małej mocy, a następnie przełącz się na mikroskop dużej mocy do liczenia. Odpowiednio dostosuj intensywność światła mikroskopu. W przypadku mikroskopów, które wykorzystują lustra do oświetlenia, należy uważać, aby nie zbaczać z jednej strony światła, w przeciwnym razie nie będzie łatwo wyraźnie zobaczyć w polu widzenia kwadratowych linii pomieszczenia zliczania lub tylko pionowe lub poziome linie będą widoczne. być widzianym. Jeśli okaże się, że roztwór bakteryjny jest zbyt stężony lub zbyt rozcieńczony przed zliczaniem, konieczne jest ponowne dostosowanie rozcieńczenia przed zliczaniem. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie próbki wymaga około 5 do 10 bakterii w każdej małej komórce. Każda komora zliczająca wybiera do liczenia 5 środkowych komórek (opcjonalnie 4 rogi i jedną środkową komórkę w środku). Komórki znajdujące się na linii siatki są generalnie liczone tylko na górnej i prawej linii. W przypadku pączkowania drożdży, gdy rozmiar pąka osiągnie połowę komórki macierzystej, liczy się to jako dwie komórki bakteryjne. Aby policzyć próbkę, oblicz zawartość bakterii w próbce, obliczając średnią wartość z dwóch komór liczących.
5. Przemyj morfologię krwi
Po użyciu opłukać tablicę do liczenia krwinek wodą z kranu, nie szorować twardymi przedmiotami, a po umyciu wysuszyć samodzielnie lub suszarką do włosów. Badanie mikroskopowe w celu zaobserwowania, czy w każdej małej komórce znajdują się pozostałości bakterii lub innych osadów. Jeśli nie jest czysty, należy go wielokrotnie prać, aż będzie czysty.
