Różnice oraz zalety i wady między transmisyjną mikroskopią fluorescencyjną a mikroskopią fluorescencyjną refleksyjną
1. Transmisyjny mikroskop fluorescencyjny: Źródło światła wzbudzającego przepuszczane jest przez materiał próbki przez kondensator w celu wzbudzenia fluorescencji. Powszechnie używane koncentratory ciemnego pola lub zwykłe koncentratory można zastosować do regulacji reflektora w celu konwersji światła wzbudzenia i światła bocznego na próbkę. Jest to stosunkowo staromodny mikroskop fluorescencyjny. Jego zaletą jest silna fluorescencja przy małym powiększeniu, natomiast wadą jest to, że jej fluorescencja słabnie wraz ze wzrostem powiększenia. Dlatego lepiej jest obserwować większe próbki materiałów.
2. Mikroskop fluorescencyjny ze wiązką opadającą: Jest to nowy typ mikroskopu fluorescencyjnego, który rozwinął się w czasach współczesnych. W odróżnieniu od poprzedniego, światło wzbudzenia pada z soczewki obiektywu na powierzchnię próbki, wykorzystując tę samą soczewkę obiektywu, co kondensator oświetlający i soczewka obiektywu do zbierania fluorescencji. Do ścieżki optycznej należy dodać dwukolorowy separator wiązki, który tworzy z fotouranem kąt 45 stopni. Światło wzbudzenia odbija się od soczewki obiektywu i gromadzi się na próbce. Fluorescencja generowana przez próbkę i światło wzbudzenia odbite od powierzchni soczewki obiektywu i szkła nakrywkowego jednocześnie wchodzą do soczewki obiektywu i powracają do dwukolorowego separatora wiązek, oddzielając światło wzbudzenia i fluorescencję. Resztkowe światło wzbudzenia jest następnie pochłaniane przez filtr blokujący. Jeśli stosowane są różne kombinacje filtrów wzbudzenia, dwubarwnych separatorów wiązek i filtrów blokujących, mogą one zaspokoić potrzeby różnych produktów reakcji fluorescencyjnej. Zaletami tego mikroskopu fluorescencyjnego są równomierne oświetlenie pola widzenia, wyraźne obrazowanie i silniejsza fluorescencja przy większym powiększeniu.
Zalety i wady transmisyjnej mikroskopii fluorescencyjnej
Źródło światła: Wysokoprężna lampa rtęciowa lub lampa halogenowa.
Lustro punktowe: użycie reflektora z ciemnym polem do oddzielenia wzbudzenia i fluorescencji.
Obiektyw: Można zastosować dowolny typ obiektywu.
Próbka: Cienkie próbki są bardziej odpowiednie do obserwacji transmisji.
Zalety: ① Dzięki zastosowaniu kondensora ciemnego pola światło wzbudzające nie może przedostać się do obiektywu, co ułatwia utworzenie ciemnego tła i uzyskanie dobrego kontrastu, a do obserwacji można zastosować dowolny obiektyw. ② Podczas korzystania z obiektywu o małym powiększeniu jest on jaśniejszy niż odblaskowy mikroskop fluorescencyjny.
Wada: Środek i wysokość reflektora muszą być odpowiednio ustawione, w przeciwnym razie nie można uzyskać jasnego obrazu fluorescencyjnego. Ze względu na ograniczoną ogniskową reflektora ciemnego pola nie można stosować grubych szkiełek. Obszar oświetlenia pola widzenia nie powinien być zbyt duży, w przeciwnym razie może to spowodować blaknięcie koloru fluorescencji próbki fluorescencyjnej. Grube lub nieprzezroczyste próbki nie są odpowiednie.
Zalety i wady odblaskowej mikroskopii fluorescencyjnej
Źródło światła: Wysokoprężna lampa rtęciowa lub lampa halogenowa.
Soczewka skupiająca: Ponieważ soczewka obiektywu służy jako soczewka skupiająca, nie ma potrzeby stosowania soczewki skupiającej.
Soczewka obiektywu: Stosowana soczewka obiektywu musi przepuszczać wystarczającą ilość światła ultrafioletowego i sama nie wytwarzać fluorescencji, bez ograniczeń co do apertury numerycznej.
Okaz: Można zaobserwować zarówno próbki grube, jak i nieprzezroczyste.
Zalety: ① Ponieważ obiektyw służy również jako reflektor, nie wymaga dużej regulacji. ② Stosując metodę oświetlenia Kolara, można wykorzystać efekty apertury i apertury pola widzenia. Apertura numeryczna obiektywu nie jest ograniczona, a obrazy o wysokiej rozdzielczości można uzyskać także przy dużym powiększeniu. Grube lub nieprzezroczyste próbki mogą być również badane można również zastosować grube szkiełka nakrywkowe. Inne metody obserwacji można również połączyć z odbitą fluorescencją, szczególnie z metodą różnicy faz i metodą interferencji różnicowej transmisji. Pozwala to uniknąć niepotrzebnego zjawiska blaknięcia kolorów fluorescencji.
Wada: podczas korzystania z obiektywu o powiększeniu podstawowym obraz jest stosunkowo ciemny, dlatego należy używać obiektywu o dużej aperturze numerycznej. System filtrów musi skutecznie oddzielać luminescencję wzbudzenia od fluorescencji.,
