Różnice i cechy mikroskopu fluorescencyjnego i zwykłego mikroskopu optycznego
Mikroskop fluorescencyjny różni się od zwykłego mikroskopu optycznego. Nie obserwuje preparatu poprzez oświetlenie zwykłym źródłem światła. Zamiast tego wykorzystuje światło o określonej długości fali (zwykle światło ultrafioletowe, światło niebiesko-fioletowe) do wzbudzenia materiału fluorescencyjnego w próbce pod mikroskopem, powodując emisję fluorescencji. Dlatego źródło światła mikroskopu fluorescencyjnego nie służy jako bezpośrednie oświetlenie, ale jako źródło energii, które wzbudza wewnętrzny materiał fluorescencyjny próbki. Powodem, dla którego możemy obserwować preparat, nie jest oświetlenie źródła światła, ale zjawisko fluorescencji spowodowane przez materiał fluorescencyjny w preparacie pochłaniający wzbudzoną energię świetlną. Można zauważyć, że główną cechą mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że jego źródło światła może dostarczyć dużą ilość światła wzbudzającego w określonym zakresie długości fal, dzięki czemu substancje fluorescencyjne w badanej próbce mogą uzyskać niezbędne natężenie światła wzbudzającego. Jednocześnie mikroskopy fluorescencyjne muszą mieć odpowiednie systemy filtrów. Mikroskopia fluorescencyjna jest niezbędnym narzędziem do zaawansowanej histochemii fluorescencyjnej. Składa się z ultrawysokociśnieniowego źródła światła, układu filtrów (w tym płytek filtrów wzbudzających i tłumiących), układu optycznego i układu fotograficznego. Wykorzystuje światło o określonej długości fali, aby pobudzić próbkę do emisji fluorescencji.
1. Sposoby wzbudzania fluorescencji: Ze względu na zakres długości fali światła dzieli się je na dwa typy: metodę wzbudzenia UV (metoda oświetlenia ultrafioletowego) i metodę wzbudzenia BV (przy użyciu światła niebiesko-fioletowego). Metoda wzbudzenia UV wykorzystuje do wzbudzenia światło bliskie ultrafioletowi o długości fali krótszej niż 400 nm. W tej metodzie nie ma widocznego światła wzbudzającego, więc obserwowana fluorescencja wskazuje na nieodłączną fluorescencję barwnika, co ułatwia odróżnienie specyficznej fluorescencji na próbce od autofluorescencji tkanki tła.
2. Metoda wzbudzenia BV: wzbudzenie od ultrafioletu do światła niebieskiego skupionego przy 404 nm i 434 nm. W metodzie tej do oświetlenia próbki wykorzystuje się światło niebieskie, dlatego też filtr odcinający systemu obserwacji fluorescencji musi wykorzystywać filtr, który może całkowicie blokować światło niebieskie i całkowicie przepuszczać wymaganą fluorescencję w kolorze zielonym i żółtym. Barwniki fluorescencyjne stosowane w metodach wykorzystujących przeciwciała fluorescencyjne. Długość fali maksymalnej absorpcji światła wzbudzenia i długość fali maksymalnej emisji fluorescencji są stosunkowo bliskie, dlatego filtr stosowany w metodzie wzbudzenia BV musi wykorzystywać filtr o ostrym odcięciu. W metodzie tej można wykorzystać światło niebieskie jako światło wzbudzające, dzięki czemu skuteczność absorpcji pigmentów fluorescencyjnych jest wyższa i można uzyskać jaśniejsze obrazy. Wadą jest to, że fluorescencja poniżej 500 nm nie jest widoczna, natomiast fluorescencja powyżej 500 nm powoduje, że cały obraz wydaje się żółty. W metodzie przeciwciał fluorescencyjnych specyficzność barwnika fluorescencyjnego ocenia się głównie na podstawie jego unikalnego koloru. Dlatego przy omawianiu subtelnej specyfiki często duży wpływ mają wyżej wymienione niedociągnięcia metody wzbudzenia BV.
