Bezpośrednie liczenie mikroorganizmów za pomocą mikroskopu
Zasada eksperymentalna
Powszechnie stosowaną metodą liczenia drobnoustrojów jest bezpośrednie liczenie pod mikroskopem przy użyciu hemocytometru. Zaletą tej metody jest to, że jest intuicyjna i szybka. Umieścić odpowiednio rozcieńczoną zawiesinę bakterii (lub zawiesinę zarodników) w komorze zliczania pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru i zliczyć pod mikroskopem. Ponieważ objętość komory zliczającej jest stała (0,1 mm2), można ją przeliczyć na całkowitą liczbę mikroorganizmów na jednostkę objętości, zgodnie z liczbą mikroorganizmów obserwowanych pod mikroskopem. Ponieważ metoda ta liczy sumę żywych i martwych bakterii, nazywana jest także metodą całkowitego liczenia bakterii.
Hemocytometr to zwykle specjalny szklany szkiełko, na którym cztery rowki tworzą trzy platformy. Platforma pośrodku podzielona jest na dwie połowy krótkim poziomym rowkiem. Na platformie z każdej strony wygrawerowana jest siatka. Każda siatka jest podzielona na dziewięć dużych kwadratów. Duży plac pośrodku to sala liczenia. Mikroorganizmy zliczane są w komorze zliczającej. Strukturę tablicy do liczenia krwinek pokazano na rysunku Ⅷ-1.
Skala pokoju liczenia ma zazwyczaj dwie specyfikacje. Pierwsza polega na tym, że duży kwadrat jest podzielony na 16 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 25 małych kwadratów (rysunek Ⅷ-2). drugi to duży kwadrat. Kwadrat jest podzielony na 25 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 16 małych kwadratów (rysunek Ⅷ-1, C). Ale niezależnie od rodzaju planszy do liczenia, liczba małych kwadratów w każdym dużym kwadracie jest taka sama, czyli 16×25=400 małych kwadratów, jak pokazano na rysunku Ⅷ-2.
Długość boku każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm, a powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2. Po zakryciu szkiełka nakrywkowego wysokość pomiędzy szkiełkiem szkiełkowym a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0,1 mm, więc objętość komory zliczającej wynosi 0,1 mm3.
Podczas liczenia zwykle należy policzyć całkowitą liczbę bakterii w pięciu środkowych siatkach, następnie uzyskać średnią wartość w każdej środkowej siatce, a następnie pomnożyć przez 16 lub 25, aby otrzymać całkowitą liczbę bakterii w dużej siatce, a następnie przeliczyć na całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego.
Sprzęt laboratoryjny
Hemocytometr, mikroskop, szkiełko nakrywkowe, sterylna kapilara;
Materiały eksperymentalne
Zawiesina Saccharomyces cerevisiae
Procedura eksperymentalna (metoda zliczania bezpośredniego pod mikroskopem mikrobiologicznym)
1. rozcieńczenie
Odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę Saccharomyces cerevisiae. Jeżeli roztwór bakteryjny nie jest gęsty, nie trzeba go rozcieńczać.
2. Mikroskopijna liczarnia
Przed dodaniem próbek należy przeprowadzić kontrolę mikroskopową komory zliczającej płytki zliczającej. Jeśli jest brud, należy go oczyścić przed zliczeniem.
3. dodaj próbkę
Przykryj czystą i suchą płytkę hemocytometru szkiełkiem nakrywkowym, a następnie za pomocą sterylnego, wąskiego zakraplacza upuść małą kroplę rozcieńczonego roztworu Saccharomyces cerevisiae z krawędzi szkiełka nakrywkowego (nie za dużo), tak aby roztwór bakterii jest blisko szczeliny wzdłuż szczeliny. Osmoza kapilarna sama wchodzi do komory zliczającej, a ogólną komorę zliczającą można napełnić płynem bakteryjnym. Uważaj, aby nie pozostały pęcherzyki powietrza.
4. liczba mikroskopów
Po 5 minutach odpoczynku umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu, najpierw użyj soczewki o małej mocy, aby znaleźć lokalizację komory zliczającej, a następnie przełącz się na soczewkę o dużej mocy do zliczania. Jeżeli przed zliczeniem okaże się, że roztwór bakterii jest za gęsty lub za rzadki, konieczne jest ponowne dostosowanie rozcieńczenia przed zliczeniem. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie próbki wymaga około 5-10 bakterii w każdej komórce. Każda komora zliczająca wybiera bakterie do liczenia na 5 środkowych siatkach (opcjonalnie 4 narożniki i siatki środkowe). Bakterie na linii siatki są zazwyczaj liczone tylko na górnej i prawej linii. W przypadku pączkowania drożdży, gdy wielkość pąka osiągnie połowę wielkości komórki macierzystej, należy policzyć dwie bakterie. Policz próbkę, aby obliczyć zawartość bakterii w próbce na podstawie wartości zliczonych w dwóch komorach zliczających.
5. Czyszczenie hemocytometru
Po użyciu płytkę do liczenia krwinek znajdującą się na kranie należy opłukać strumieniem wody, nie myć twardymi przedmiotami, a po umyciu wysuszyć samodzielnie lub suszarką do włosów. Badanie mikroskopowe i obserwacja, czy w każdej komórce znajdują się resztki bakterii lub innych osadów. Jeśli nie jest czysty, należy go wielokrotnie prać, aż będzie czysty.
