Bezpośrednie liczenie mikrobów za pomocą mikroskopu
Zasada eksperymentalna
Bezpośrednie liczenie pod mikroskopem za pomocą hemocytometru jest powszechnie stosowaną metodą liczenia drobnoustrojów. Zaletą tej metody jest to, że jest intuicyjna i szybka. Umieść odpowiednio rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną (lub zawiesinę zarodników) w komorze do zliczania między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru i policz pod mikroskopem. Ponieważ objętość komory zliczającej jest stała (0,1 mm2), można ją przeliczyć na całkowitą liczbę mikroorganizmów na jednostkę objętości zgodnie z liczbą mikroorganizmów obserwowanych pod mikroskopem. Ponieważ ta metoda liczy sumę żywych i martwych bakterii, jest również nazywana metodą całkowitej liczby bakterii.
Hemocytometr to zwykle specjalne szklane szkiełko, na którym cztery rowki tworzą trzy platformy. Platforma pośrodku podzielona jest na dwie połowy krótkim poziomym rowkiem. Na platformie po każdej stronie wygrawerowana jest siatka. Każda siatka jest podzielona na dziewięć dużych kwadratów. Duży kwadrat pośrodku to pomieszczenie do liczenia. Mikroorganizmy są zliczane w komorze zliczeniowej. Strukturę tablicy do liczenia krwinek pokazano na rycinie Ⅷ-1.
Skala pokoju liczenia ma na ogół dwie specyfikacje, po pierwsze, duży kwadrat jest podzielony na 16 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 25 małych kwadratów (Rysunek Ⅷ -2); drugi to duży kwadrat Kwadrat jest podzielony na 25 środkowych kwadratów, a każdy środkowy kwadrat jest podzielony na 16 małych kwadratów (Rysunek Ⅷ{5}}, C). Ale bez względu na rodzaj planszy do liczenia, liczba małych kwadratów w każdym dużym kwadracie jest taka sama, czyli 16×25=400 małych kwadratów, jak pokazano na rysunku Ⅷ{8}}.
Długość boku każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm, a pole każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2. Po zakryciu szkiełka nakrywkowego wysokość między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0,1 mm, więc objętość komory zliczającej wynosi 0,1 mm3.
Podczas liczenia należy zwykle policzyć całkowitą liczbę bakterii w pięciu środkowych kwadratach, następnie uzyskać średnią wartość każdego środkowego kwadratu, a następnie pomnożyć przez 16 lub 25, aby uzyskać całkowitą liczbę bakterii w dużym kwadracie, a następnie przeliczyć na całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego.
Sprzęt laboratoryjny
Hemocytometr, mikroskop, szkiełko nakrywkowe, sterylna kapilara;
Materiały eksperymentalne
Zawiesina Saccharomyces cerevisiae
Procedura eksperymentalna (metoda bezpośredniego liczenia pod mikroskopem mikrobiologicznym)
1. rozcieńczenie
Odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę Saccharomyces cerevisiae. Jeśli roztwór bakteryjny nie jest gęsty, nie trzeba go rozcieńczać.
2. Mikroskopijne pomieszczenie do liczenia
Przed dodaniem próbek należy wykonać badanie mikroskopowe komory zliczeniowej płytki zliczającej. Jeśli jest brud, należy go wyczyścić przed liczeniem.
3. dodaj próbkę
Przykryć czystą i suchą płytkę hemocytometru szkiełkiem nakrywkowym, a następnie za pomocą sterylnego zakraplacza z wąską szyjką upuścić małą kroplę rozcieńczonego roztworu Saccharomyces cerevisiae z krawędzi szkiełka nakrywkowego (nie za dużo), tak aby roztwór bakterii jest blisko szczeliny wzdłuż szczeliny. Osmoza kapilarna sama wchodzi do komory zliczeniowej, a ogólną komorę zliczeniową można wypełnić płynem bakteryjnym. Uważaj, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
4. liczba mikroskopowa
Po odpoczynku przez 5 minut umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu, najpierw użyj soczewki o małej mocy, aby znaleźć lokalizację komory zliczającej, a następnie przełącz się na soczewkę o dużej mocy do liczenia. Jeśli okaże się, że roztwór bakteryjny jest zbyt gęsty lub zbyt rzadki przed zliczaniem, konieczne jest ponowne dostosowanie rozcieńczenia przed zliczaniem. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie próbki wymaga około 5-10 bakterii w każdej komórce. Każda komora zliczająca wybiera bakterie z 5 środkowych siatek (opcjonalnie 4 narożniki i środkowe siatki) do liczenia. Bakterie na linii siatki są zazwyczaj liczone tylko na górnej i prawej linii. W przypadku pączkowania drożdży, gdy rozmiar pąka osiągnie połowę komórki macierzystej, policz dwie bakterie. Policz próbkę, aby obliczyć zawartość bakterii w próbce na podstawie wartości zliczonych w dwóch komorach do zliczania.
5. Czyszczenie hemocytometru
Po użyciu wypłukać płytkę do liczenia krwinek na kranie strumieniem wody, nie myć jej twardymi przedmiotami, a po umyciu wysuszyć samodzielnie lub suszarką do włosów. Badanie mikroskopowe, obserwacja, czy w każdej komórce znajdują się pozostałości bakterii lub innych osadów. Jeśli nie jest czysty, należy go wielokrotnie prać, aż będzie czysty.
