Różnice i cechy mikroskopu fluorescencyjnego i zwykłego mikroskopu optycznego
Mikroskop fluorescencyjny i zwykły mikroskop optyczny są różne. Obserwacja próbki nie polega na oświetleniu zwykłego źródła światła, ale na wzbudzeniu materiału fluorescencyjnego w próbce za pomocą określonej długości fali światła (zwykle światła ultrafioletowego, niebiesko-fioletowego). pod mikroskopem, tak że fluorescencja źródła światła mikroskopu fluorescencyjnego nie odgrywa bezpośredniego oświetlenia, ale jako rodzaj wzbudzenia materiału fluorescencyjnego w próbce źródła energii. Powodem, dla którego możemy obserwować próbkę, nie jest oświetlenie źródła światła, ale zjawisko fluorescencji prezentowane przez materiał fluorescencyjny w próbce po pochłonięciu energii świetlnej wzbudzenia. Można zauważyć, że charakterystyka mikroskopu fluorescencyjnego, a przede wszystkim jego źródło światła, pozwala na dostarczenie dużej liczby określonych zakresów długości fal światła wzbudzającego, dzięki czemu materiał fluorescencyjny w badanej próbce może uzyskać niezbędne natężenie światła wzbudzającego. Jednocześnie mikroskop fluorescencyjny musi mieć odpowiedni system filtrów. Podstawowym narzędziem do histochemii fluorescencyjnej jest mikroskop fluorescencyjny. Składa się z ultrawysokociśnieniowego źródła światła, układu filtrów (w tym płytki filtra wzbudzającego i tłumiącego), układu optycznego i układu fotograficznego oraz innych głównych elementów. Polega na wykorzystaniu określonej długości fali światła w celu pobudzenia próbki do emisji fluorescencji.
1. sposób wzbudzenia fluorescencji: w zależności od zakresu długości fali światła dzieli się na metodę wzbudzenia UV (przy użyciu oświetlenia ultrafioletowego) i metodę wzbudzenia BV (przy użyciu światła niebiesko-fioletowego). Dwa rodzaje metod wzbudzenia UV są krótsze niż 400 nm w pobliżu światła ultrafioletowego pobudzenie. W tej metodzie nie ma widocznego światła wzbudzającego, zatem obserwowana fluorescencja wskazuje na nieodłączną fluorescencję barwnika i łatwo jest odróżnić specyficzną fluorescencję na próbce od samofluorescencji tkanki tła.
2. Metoda wzbudzenia BV: Metoda koncentruje się na długości fali 404 nm, 434 nm od ultrafioletu do światła niebieskiego w celu wzbudzenia. W tej metodzie do napromieniania próbki wykorzystuje się światło niebieskie, dlatego też filtr odcinający systemu obserwacji fluorescencji musi wykorzystywać filtr, który może całkowicie zablokować światło niebieskie i odpowiednio przepuszczać pożądaną fluorescencję w kolorze zielonym i żółtym. Pigmenty fluorescencyjne do metody z przeciwciałami fluorescencyjnymi. Ponieważ długość fali maksymalnej absorpcji światła wzbudzającego i długość fali maksymalnej emisji fluorescencji są blisko siebie, filtry stosowane w metodzie wzbudzenia BV muszą być filtrami o ostrym odcięciu. W tej metodzie jako światło wzbudzające wykorzystuje się światło niebieskie, dzięki czemu skuteczność absorpcji fluorochromu jest większa i można uzyskać jaśniejszy obraz. Wadą jest to, że fluorescencja poniżej 500 nm jest niewidoczna, a powyżej 500 nm cały obraz wydaje się żółty. W metodzie fluorescencyjnej przeciwciał większość specyficzności ocenia się na podstawie unikalnego koloru fluorochromu, więc opisane powyżej wady metody wzbudzenia BV wydają się być niezwykle wpływowe przy omawianiu subtelnej specyficzności.
