Wiedza związana z mikroskopem fluorescencyjnym
Podstawowa zasada konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej: do napromieniowania preparatu stosuje się punktowe źródło światła, a na płaszczyźnie ogniskowej tworzy się dobrze zdefiniowana mała plamka świetlna. składa się z rozgałęźników. Dzielnik wiązki wysyła fluorescencję bezpośrednio do detektora. Przed źródłem światła i detektorem znajduje się otworek, zwany odpowiednio otworem oświetlenia i otworem wykrywania. Rozmiar geometryczny obu jest taki sam, około 100-200nm; w stosunku do plamki świetlnej na płaszczyźnie ogniskowej, oba są sprzężone, to znaczy plamka świetlna przechodzi przez szereg soczewek i ostatecznie może być skupiona na otworku oświetlenia i otworku detekcyjnym w tym samym czasie. W ten sposób światło z płaszczyzny ogniskowej może być skupione w zakresie otworu detekcyjnego, podczas gdy światło rozproszone z góry lub z dołu płaszczyzny ogniskowej jest blokowane na zewnątrz otworu detekcyjnego i nie może zostać zobrazowane. Laser skanuje próbkę punkt po punkcie, a fotopowielacz po wykryciu otworka uzyskuje również konfokalny obraz odpowiedniego światła punkt po punkcie, który jest przetwarzany na sygnał cyfrowy i przesyłany do komputera, a na końcu agregowany w wyraźny obraz konfokalny całej płaszczyzny ogniskowej na ekranie.
Każdy obraz w płaszczyźnie ogniskowej jest w rzeczywistości optycznym przekrojem poprzecznym próbki, a ten przekrój optyczny zawsze ma określoną grubość, zwaną również przekrojem optycznym cienkim. Ponieważ intensywność światła w ognisku jest znacznie większa niż w punkcie poza ogniskiem, a światło w płaszczyźnie nieogniskowej jest filtrowane przez otworek, głębia ostrości systemu konfokalnego wynosi w przybliżeniu zero, a skanowanie wzdłuż osi Z -axis może realizować tomografię optyczną, tworząc Obserwować dwuwymiarowy przekrój optyczny w skupionym miejscu próbki. Łącząc skanowanie płaszczyzny XY (płaszczyzny ogniskowej) ze skanowaniem osi Z (osi optycznej), trójwymiarowy obraz próbki można uzyskać poprzez gromadzenie dwuwymiarowych obrazów ciągłych warstw i przetwarzanie ich za pomocą specjalnego oprogramowania komputerowego.
Oznacza to, że otworek detekcyjny i otworek źródła światła są zawsze skupione w tym samym punkcie, tak że fluorescencja wzbudzona poza płaszczyzną ogniskowania nie może wejść do otworka detekcyjnego.
Prostym wyrażeniem zasady działania lasera konfokalnego jest to, że wykorzystuje on światło lasera jako źródło światła. W oparciu o tradycyjne obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego dodaje laserowe urządzenie skanujące i sprzężone urządzenie ogniskujące oraz jest systemem do pozyskiwania i przetwarzania cyfrowego obrazu za pomocą sterowania komputerowego.
