Czym mikroskopia fluorescencyjna różni się od mikroskopii konwencjonalnej
Niedawno próbowałem zrobić kilka zamrożonych skrawków myszy, a teraz muszę użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy wirus, który wstrzyknąłem, znajduje się w pożądanym obszarze mózgu. Należy pokrótce przestudiować niektóre podstawowe zasady mikroskopii fluorescencyjnej i podzielę się nimi również tutaj.
Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje światło ultrafioletowe jako źródło światła do oświetlenia badanego obiektu, powodując wyemitowanie przez obiekt źródła światła, a następnie obserwowanie obiektu pod mikroskopem. Stosowany głównie w komórkach immunofluorescencyjnych, składa się ze źródła światła, układu płytek filtracyjnych i układu optycznego do obserwacji obrazu fluorescencyjnego próbki poprzez powiększenie okularu i soczewki obiektywu. Przyjrzyjmy się różnicy między tym mikroskopem fluorescencyjnym a zwykłym mikroskopem optycznym.
1. Jeśli chodzi o metody oświetlenia
Metoda oświetlania mikroskopu fluorescencyjnego zazwyczaj wykorzystuje metodę wiązki padającej, co oznacza, że źródło światła jest rzutowane na badaną próbkę przez soczewkę obiektywu.
2. Pod względem rozdzielczości
Mikroskopia fluorescencyjna jako źródło światła wykorzystuje światło ultrafioletowe o stosunkowo krótkiej długości fali, ale wyższej rozdzielczości niż zwykłe mikroskopy optyczne.
3. Różnice w filtrze
Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje dwa specjalne filtry, jeden przed źródłem światła w celu odfiltrowania światła widzialnego, a drugi między obiektywem a okularem w celu odfiltrowania światła ultrafioletowego, które może chronić oczy.
Mikroskopia fluorescencyjna jest również rodzajem mikroskopu optycznego, głównie dlatego, że długość fali wzbudzana przez mikroskopię fluorescencyjną jest krótka, co prowadzi do różnic w strukturze i zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej i zwykłej mikroskopii. Większość mikroskopów fluorescencyjnych ma dobrą funkcję wychwytywania słabego światła, więc ich zdolność obrazowania jest dobra również w przypadku wyjątkowo słabej fluorescencji. Ponadto dzięki ciągłemu doskonaleniu mikroskopii fluorescencyjnej w ostatnich latach znacznie zmniejszono również hałas. Dlatego też coraz częściej stosuje się mikroskopy fluorescencyjne.
Wiedza związana z dwufotonową mikroskopią fluorescencyjną
Podstawowa zasada wzbudzenia dwufotonowego polega na tym, że przy dużej gęstości fotonów cząsteczki fluorescencyjne mogą jednocześnie zaabsorbować dwa fotony o dużej długości fali, a po krótkim okresie tzw. czasu życia w stanie wzbudzonym wyemitować foton o krótszej długości fali; Jego działanie jest takie samo, jak użycie fotonu o długości fali równej połowie dłuższej fali do wzbudzenia cząsteczek fluorescencyjnych. Wzbudzenie dwoma fotonami wymaga dużej gęstości fotonów, a aby uniknąć uszkodzenia komórek, w mikroskopie dwufotonowym zastosowano laser impulsowy o wysokiej energii z synchronizacją modów. Laser emitowany przez tego typu laser ma wysoką energię szczytową i niską energię średnią, przy szerokości impulsu wynoszącej zaledwie 100 femtosekund i częstotliwości dochodzącej do 80 do 100 megaherców. W przypadku stosowania obiektywu o dużej aperturze numerycznej do ogniskowania fotonów lasera pulsacyjnego gęstość fotonów w ognisku obiektywu jest najwyższa, a wzbudzenie dwufotonowe występuje tylko w ognisku obiektywu. Dlatego mikroskop dwufotonowy nie wymaga konfokalnych otworków, co poprawia skuteczność detekcji fluorescencji.
Ogólnie rzecz biorąc, zjawisko fluorescencji, ze względu na niską gęstość wzbudzenia fotonów, cząsteczka fluorescencyjna może absorbować tylko jeden foton w tym samym czasie, a następnie emitować jeden foton fluorescencyjny poprzez przejście promieniowania, które nazywa się fluorescencją pojedynczego fotonu. W procesie wzbudzenia fluorescencji z wykorzystaniem lasera jako źródła światła mogą wystąpić zjawiska fluorescencji dwufotonowej, a nawet wielofotonowej. W tym momencie stosowane źródło światła wzbudzającego ma dużą intensywność, a gęstość fotonów spełnia wymagania, aby cząsteczki fluorescencyjne absorbowały dwa fotony jednocześnie. W procesie wykorzystania typowego lasera jako źródła światła wzbudzającego gęstość fotonów jest w dalszym ciągu niewystarczająca do wygenerowania zjawiska absorpcji dwufotonowej. Zazwyczaj stosuje się lasery impulsowe femtosekundowe, których moc chwilowa może sięgać poziomu megawatów. Dlatego długość fali fluorescencji dwufotonowej jest krótsza niż długość fali wzbudzenia, co jest równoważne efektowi wywołanemu wzbudzeniu o połowie długości fali wzbudzenia.
