Jak wybrać odpowiedni mikroskop fluorescencyjny
Mikroskop fluorescencyjny jest standardowym wyposażeniem laboratoriów i oddziałów patologii. Wykorzystuje charakterystykę fluorescencji do obserwacji i obrazowania. Jest szeroko stosowany w biologii komórki, neurobiologii, botanice, mikrobiologii, patologii, genetyce i innych dziedzinach. Obrazowanie fluorescencyjne ma zalety wysokiej czułości i wysokiej specyficzności i jest bardzo odpowiednie do obserwacji rozmieszczenia określonych białek i organelli w tkankach i komórkach, badania kolokalizacji i interakcji, śledzenia dynamicznych procesów życiowych, takich jak zmiany stężenia jonów itp.
Wybór mikroskopu
Mikroskopy fluorescencyjne dzielą się głównie na trzy kategorie: stojące mikroskopy fluorescencyjne (nadające się do cięcia na skrawki), odwrócone mikroskopy fluorescencyjne (nadające się do żywych komórek, biorąc pod uwagę cięcie), stereoskopowe mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do większych okazów, takich jak rośliny, danio pręgowany (dorosły/ zarodek), medaka, narządy myszy/szczura itp.).
Wybór kostek filtrów fluorescencyjnych
Oprócz uwzględnienia długości fal wzbudzenia i emisji sond fluorescencyjnych, przy wyborze bloków filtrów należy również wziąć pod uwagę, czy istnieje niespecyficzne wzbudzenie i przebarwienie dla próbek oznaczonych wielokolorowo. W eksperymencie spróbujemy wybrać dla wzbudzenia długość fali najbliższą pikowi wzbudzenia, a zakres odbioru musi zawierać pik emisji. Na przykład szczyt wzbudzenia Alexa Fluor 488 wynosi 500 nm, aw mikroskopie fluorescencyjnym można wybrać filtr wzbudzenia 480/40. Kostki filtrów fluorescencyjnych powszechnie stosowane w mikroskopach fluorescencyjnych można podzielić na dwa rodzaje: długoprzepustowe (w skrócie LP) i pasmowoprzepustowe (w skrócie BP), które również należy dobrać do potrzeb.
Wybór fluorescencyjnego źródła światła
Obecnie powszechnie stosowane fluorescencyjne źródła światła obejmują lampy rtęciowe, lampy metalohalogenkowe i źródła światła LED, które szybko się rozwinęły w ostatnich latach. Widmo fluorescencyjnego źródła światła jest ciągłe i nieciągłe, a energia będzie różna w różnych pasmach. Ze względu na stosunkowo wąskie pasmo widmowe, bardziej stabilną moc wyjściową, długą żywotność, bezpieczeństwo i ochronę środowiska oraz wiele innych zalet, źródło światła LED stopniowo staje się głównym źródłem światła mikroskopu fluorescencyjnego.
mikroskop konfokalny
W tradycyjnych obserwacjach mikroskopem fluorescencyjnym, ze względu na nakładanie się fluorescencyjnych substancji znacznikowych i struktur autofluorescencyjnych, są one ściśle połączone, podczas gdy soczewka obiektywowa tradycyjnego mikroskopu epifluorescencyjnego nie tylko zbiera światło z płaszczyzny ogniskowej, ale także zbiera światło rozproszone powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej, co skutkuje znacznie zmniejszoną rozdzielczością i kontrastem obrazu.
Obrazowanie konfokalne rozwiązuje ten problem, wykrywając tylko część światła odbitego od płaszczyzny ogniskowej. Źródło światła przechodzi przez otwór, tworząc małą i cienką plamkę światła na płaszczyźnie ogniskowej. Światło emitowane z płaszczyzny ogniskowej jest zbierane przez soczewkę obiektywu. Większość fluorescencji emitowanej z punktu powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu nie może zbiegać się do małego otworu. Tylko fluorescencja znajdująca się w płaszczyźnie ogniskowej i niewielka część fluorescencji poza ogniskiem może przejść przez otworek, podczas gdy wiązki światła poza płaszczyzną ogniskową zbiegają się z przodu lub z tyłu płytki otworkowej i są blokowane przed wejściem do detektora przez otworek. Wykryty obraz jest obrazem z płaszczyzny ogniskowej, więc ostateczna jakość obrazu jest znacznie lepsza.
Ze względu na zalety i praktyczność funkcji laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, mikroskop konfokalny jest nieodzownym pomocnikiem eksperymentalnym w dziedzinie precyzyjnej biologii komórki, botaniki i badań nad komórkami. Jednocześnie w przyszłym centrum badań naukowych będzie to najbardziej podstawowe i podstawowe narzędzie badań naukowych.
