Ulepszone korzyści z wielofotonowej mikroskopii skaningowej laserowej
Laserowa skaningowa mikroskopia wielofotonowa stanowi główne udoskonalenie mikroskopii optycznej, głównie do obserwacji głębokiej struktury żywych komórek, utrwalonych komórek i tkanek i może uzyskać wyraźne i ostre wielowarstwowe struktury w płaszczyźnie Z, czyli przekroje optyczne, i może konstruować Trójwymiarowa bryła struktury próbki. Mikroskop konfokalny wykorzystuje laserowe źródło światła, które rozszerza się tak, aby wypełnić całą tylną płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu, a następnie skupia się w bardzo małym punkcie na płaszczyźnie ogniskowej preparatu poprzez układ soczewek soczewki obiektywu. W zależności od apertury numerycznej obiektywu średnica najjaśniejszego punktu oświetleniowego wynosi około 0,25 ~ 0,8 μm, a głębokość około 0,5 ~ 1,5 um. Rozmiar plamki konfokalnej zależy od konstrukcji mikroskopu, długości fali lasera, właściwości soczewki obiektywu, ustawienia stanu jednostki skanującej i rodzaju próbki. Mikroskopy polowe charakteryzują się dużym zakresem i głębokością oświetlenia, podczas gdy mikroskopy konfokalne charakteryzują się oświetleniem skupionym w ognisku w płaszczyźnie ogniskowej. Najbardziej podstawową zaletą mikroskopii konfokalnej jest to, że pozwala ona na dokładne cięcie optyczne grubych próbek fluorescencyjnych (do 5{12}} μm lub więcej) o grubości od około 0,5 do 1,5 μm. Serię obrazów przekroju optycznego można uzyskać, przesuwając preparat w górę i w dół za pomocą silnika krokowego osi Z mikroskopu. Pozyskiwanie informacji o obrazie jest kontrolowane w precyzyjnej płaszczyźnie i nie będzie zakłócane przez sygnały z innych miejsc próbki. Po usunięciu efektu fluorescencji tła i zwiększeniu stosunku sygnału do szumu, kontrast i rozdzielczość obrazów konfokalnych ulegają znacznej poprawie w porównaniu z tradycyjnymi obrazami fluorescencyjnymi przy oświetleniu polowym. W wielu okazach wiele skomplikowanych elementów konstrukcyjnych jest ze sobą powiązanych, tworząc złożone systemy, ale gdy uda się zgromadzić wystarczającą liczbę przekrojów optycznych, możemy je zrekonstruować w 3D za pomocą oprogramowania. To podejście eksperymentalne było szeroko stosowane w badaniach biologicznych w celu wyjaśnienia złożonych zależności strukturalnych i funkcjonalnych między komórkami lub tkankami.
