Wiedza na temat mikroskopii fluorescencyjnej dwufotonowej
Podstawowa zasada wzbudzenia dwoma-fotonami polega na tym, że przy dużej gęstości fotonów cząsteczki fluorescencyjne mogą jednocześnie absorbować dwa fotony o dużej długości fali i emitować foton o krótszej długości fali po krótkim-czasie życia w stanie wzbudzonym; Efekt jest taki sam, jak przy użyciu fotonu o połowie długości fali długiej fali do wzbudzenia cząsteczek fluorescencyjnych. Wzbudzenie dwoma fotonami wymaga dużej gęstości fotonów, a aby uniknąć uszkodzenia komórek, w mikroskopii dwu-fotonowej wykorzystuje się lasery impulsowe o wysokiej-trybie-energii. Laser emitowany przez ten laser ma wysoką energię szczytową i niską energię średnią, szerokość impulsu wynosi zaledwie 100 femtosekund i częstotliwość od 80 do 100 megaherców. W przypadku stosowania soczewki obiektywu o dużej aperturze numerycznej do ogniskowania fotonów lasera pulsacyjnego gęstość fotonów w ognisku soczewki obiektywu jest najwyższa, a wzbudzenie dwóch-fotonów występuje tylko w ognisku soczewki obiektywu. Dlatego mikroskop dwu-fotonowy nie wymaga konfokalnej dziurki, co poprawia skuteczność detekcji fluorescencji.
Ogólnie rzecz biorąc, zjawisko fluorescencji, ze względu na niską gęstość fotonów światła wzbudzającego, cząsteczka fluorescencyjna może absorbować tylko jeden foton na raz, a następnie emitować inny foton fluorescencyjny w drodze przejścia radiacyjnego, co jest znane jako fluorescencja pojedynczego fotonu. W przypadku procesów wzbudzania fluorescencji z wykorzystaniem laserów jako źródła światła może wystąpić zjawisko fluorescencji dwu-fotonowej lub nawet wielofotonowej. W tym przypadku zastosowane źródło światła wzbudzającego charakteryzuje się dużą intensywnością i gęstością fotonów, która spełnia wymóg, aby cząsteczki fluorescencyjne absorbowały dwa fotony jednocześnie. W procesie stosowania ogólnego lasera jako źródła światła wzbudzającego gęstość fotonów jest w dalszym ciągu niewystarczająca, aby wytworzyć zjawisko absorpcji dwóch-fotonów. Zazwyczaj stosuje się lasery impulsowe femtosekundowe, których chwilowa moc sięga poziomu megawatów. Dlatego długość fali fluorescencji dwóch-fotonów jest krótsza niż długość fali światła wzbudzenia, co jest równoważne efektowi wytwarzanemu przez wzbudzenie o połowie długości fali wzbudzenia.
