Udoskonalone zalety wielofotonowej mikroskopii skaningowej
Laserowy Skaningowy Mikroskop Wielofotonowy stanowi istotne udoskonalenie mikroskopii optycznej, głównie w zakresie możliwości obserwacji głębokiej struktury żywych i utrwalonych komórek i tkanek oraz uzyskania wyraźnych i ostrych wielowarstwowych struktur w płaszczyźnie Z, czyli przekrojów optycznych, z których można skonstruować trójwymiarową, stałą strukturę próbki. Mikroskopia konfokalna wykorzystuje źródło światła laserowego, które jest rozszerzane w celu wypełnienia całej tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu, a następnie przechodzi przez układ soczewek soczewki obiektywu, zbiegając się w bardzo małe plamki w płaszczyźnie ogniskowej próbki. W zależności od apertury numerycznej obiektywu, średnica jasnego punktu oświetleniowego wynosi około 0,25 ~ 0,8 μm, a głębokość około 0,5 ~ 1,5 µm. Rozmiar punktu konfokalnego zależy od konstrukcji mikroskopu, długości fali lasera, właściwości soczewki obiektywu, ustawienia stanu jednostki skanującej i charakteru próbki. Mikroskopy polowe charakteryzują się dużym zakresem oświetlenia i głębokością oświetlenia, podczas gdy mikroskopy konfokalne skupiają oświetlenie w jednym ognisku w płaszczyźnie ogniskowej. Najbardziej podstawową zaletą mikroskopu konfokalnego jest możliwość wykonywania drobnych przekrojów optycznych grubych próbek fluorescencyjnych (do 50 μm i więcej) o grubości przekrojów od około 0,5 do 1,5 μm. Serię obrazów przekroju optycznego można uzyskać, przesuwając preparat w górę i w dół za pomocą silnika krokowego osi Z mikroskopu. Pozyskiwanie informacji o obrazie jest kontrolowane w pierwszej płaszczyźnie i nie jest zakłócane przez sygnały emitowane z innych miejsc próbki. Po usunięciu efektów fluorescencji tła i zwiększeniu stosunku sygnału do szumu, kontrast i rozdzielczość obrazu konfokalnego ulegają znacznej poprawie w porównaniu z konwencjonalnymi obrazami fluorescencyjnymi oświetlonymi polem. W wielu okazach wiele skomplikowanych elementów konstrukcyjnych przeplata się, tworząc złożone systemy, ale gdy uda się uzyskać wystarczającą liczbę przekrojów optycznych, możemy je zrekonstruować w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania. Ta metoda eksperymentalna jest szeroko stosowana w badaniach biologicznych w celu wyjaśnienia złożonych powiązań strukturalnych i funkcjonalnych między komórkami lub tkankami.
