Pomiar ilości drobnoustrojów – mikroskopowa metoda bezpośredniego liczenia!
Wzrost populacji bakterii charakteryzuje się wzrostem liczby komórek lub wzrostem materiału komórkowego. Istnieje kilka metod pomiaru liczby komórek, w tym bezpośrednie zliczanie mikroskopowe, zliczanie płytek, turbometria za pomocą spektrofotometru, najbardziej prawdopodobna liczba MPN i filtracja membranowa. Metody pomiaru substancji komórkowych obejmują pomiar suchej masy komórek, pomiar zawartości niektórych składników komórek, takich jak azot, RNA i DNA, oraz pomiar produktów metabolicznych. Podsumowując, istnieje wiele metod pomiaru wzrostu drobnoustrojów, każda ma swoje zalety i wady, a wybór powinien opierać się na konkretnych wymaganiach pracy. Eksperyment ten głównie wprowadza powszechnie stosowaną metodę bezpośredniego liczenia mikroskopowego w pracach produkcyjnych i badawczych.
Wymagania dotyczące celu
1. Wyjaśnij zasadę wykorzystania tablicy do liczenia krwinek.
2. Opanuj metodę wykorzystania tablicy do liczenia krwinek do liczenia drobnoustrojów.
2, Podstawowe zasady
Mikroskopowa metoda bezpośredniego liczenia to prosta, szybka i intuicyjna metoda bezpośredniego zliczania niewielkiej ilości zawiesiny próbki pod mikroskopem poprzez umieszczenie jej na specjalnym szklanym szkiełku o określonej powierzchni i objętości (zwanym również licznikiem bakterii). Obecnie powszechnie stosowane urządzenia do liczenia bakterii w kraju i za granicą obejmują płytki do liczenia krwinek, urządzenia do liczenia bakterii Peteroffa Hausera i urządzenia do liczenia bakterii Hawksleya, z których wszystkie mogą być używane do zliczania zawiesin drożdży, bakterii, zarodników grzybów itp., z tą samą podstawową zasadą. Dwa ostatnie typy liczników bakterii mają całkowitą objętość {{0}},02 mm3 po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, a odległość pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nośnym wynosi tylko 0,02 mm. Dlatego do obserwacji i zliczania mniejszych komórek, takich jak bakterie, można używać obiektywu zanurzeniowego w oleju. Oprócz stosowania liczników bakterii istnieje również metoda szacowania umożliwiająca bezpośrednią obserwację stosunku powierzchni rozmazu do powierzchni pola pod mikroskopem, która jest powszechnie stosowana w badaniach bakteriologicznych mleka. Zalety bezpośredniego liczenia za pomocą mikroskopu są intuicyjne, szybkie i łatwe w obsłudze. Wadą tej metody jest jednak to, że zmierzone wyniki stanowią zazwyczaj sumę komórek martwych i żywych. Obecnie istnieją pewne metody, które mogą przezwyciężyć tę wadę, takie jak połączenie hodowli w komorze barwienia żywych komórek (krótki czas) i dodanie inhibitorów podziału komórek, aby osiągnąć cel, jakim jest zliczanie wyłącznie żywych komórek.
Wykorzystanie tablicy do liczenia krwinek jako przykładu bezpośredniego liczenia pod mikroskopem. Sposób użycia dwóch pozostałych liczników bakterii można znaleźć w instrukcjach różnych producentów. Bezpośrednie liczenie pod mikroskopem przy użyciu płytki do liczenia krwinek jest powszechnie stosowaną metodą liczenia drobnoustrojów. Tablica licząca to specjalnie wykonana szklana szkiełko z czterema rowkami tworzącymi na niej trzy platformy; Szersza platforma pośrodku jest podzielona na dwie połowy krótkim poziomym rowkiem, a po obu stronach platformy znajduje się kratka. Każda siatka jest podzielona na dziewięć dużych siatek, a duża siatka pośrodku to pomieszczenie do liczenia. Strukturę płytki do liczenia krwinek pokazano na rysunku l{0}}. Skala pokoju liczenia ma zazwyczaj dwie specyfikacje. Po pierwsze, duży kwadrat dzieli się na 25 środkowych kwadratów, a każdy kwadrat jest dalej dzielony na 16 małych kwadratów (rysunek 15-2); Inną metodą jest podzielenie dużego kwadratu na 16 środkowych kwadratów, a każdy kwadrat jest dalej dzielony na 25 małych kwadratów. Jednak niezależnie od wielkości planszy do liczenia, w każdym dużym kwadracie znajduje się 400 małych kwadratów. Jeśli długość boku każdego kwadratu wynosi 1 mm, pole każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2. Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym wysokość pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem wynosi 0,1 mm, a więc objętość komory liczącej wynosi 0,1 mm3 (jedna tysięczna mililitra). Rysunek 15-1 Struktura tablicy do liczenia krwinek (I) Rysunek 15-2 Struktura tablicy do liczenia krwinek (II) Widok z przodu; B. Przekrój pionowy; Powiększona siatka ma duży kwadrat pośrodku jako pomieszczenie do liczenia 1. Tablica do liczenia krwinek; 2. Szkło osłonowe; Podczas zliczania w pomieszczeniu liczącym całkowitą liczbę bakterii oblicza się zwykle dla pięciu kwadratów, następnie uzyskuje się średnią wartość każdego kwadratu, mnożoną przez 25 lub 16, aby otrzymać całkowitą liczbę bakterii w dużym kwadracie, którą następnie przelicza się na liczbę całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego. Zakładając, że całkowita liczba bakterii w pięciu kwadratowych siatkach wynosi A, a współczynnik rozcieńczenia roztworu bakterii wynosi B. Jeśli w kwadratowej siatce znajduje się 25 płytek do liczenia, całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakterii wynosi A/5 × 25 × 104 × B=50000A · B. Podobnie, jeśli w kwadratowej siatce znajduje się 16 płytek liczących, całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakterii wynosi A/5 × 16 × 104 × B=32000A · B
