Klasyfikacja mikroskopowa i zasada działania w badaniach komórkowych
Mikroskop jest podstawowym narzędziem do obserwacji komórek. Według różnych źródeł światła można go podzielić na dwie kategorie: mikroskopy optyczne i mikroskopy elektronowe. Pierwsza wykorzystuje światło widzialne (mikroskopy UV wykorzystują światło ultrafioletowe) jako źródło światła, podczas gdy druga wykorzystuje wiązki elektronów jako źródło światła.
-,Mikroskop optyczny
(1) Zwykły mikroskop optyczny
Zwykłe mikroskopy biologiczne składają się z trzech części, a mianowicie: ① systemu oświetlenia, w tym źródła światła i kondensatora; ② optyczny system powiększenia, składający się z obiektywu i okularu, który jest głównym korpusem mikroskopu. W celu wyeliminowania aberracji sferycznej i aberracji chromatycznej zarówno okular, jak i obiektyw ③Urządzenie mechaniczne służy do mocowania materiału i ułatwia obserwację (Rysunek 2-1).
To, czy obraz mikroskopu jest wyraźny, zależy nie tylko od powiększenia, ale także od rozdzielczości mikroskopu. Rozdzielczość odnosi się do zdolności mikroskopu (lub ludzkiego oka znajdującego się w odległości 25 cm od celu) do rozróżnienia najmniejszej odległości między obiektami. Wielkość rozdzielczości jest określona przez Długość fali i stosunek apertury światła oraz współczynnik załamania światła ośrodka wyraża się wzorem:
We wzorze: n=współczynnik załamania światła ośrodka;=kąt apertury (kąt otwarcia preparatu do apertury obiektywu), NA=apertura obiektywu (apertura numeryczna). Kąt soczewki jest zawsze mniejszy niż 180 stopni, więc maksymalna wartość sina/2 musi być mniejsza niż 1.
Współczynnik załamania światła szkła użytego do wykonania soczewki optycznej wynosi od 1,65 do 1,78, a współczynnik załamania użytego medium jest im bliżej szkła, tym lepiej. W przypadku suchych soczewek obiektywowych medium jest powietrze, a współczynnik apertury obiektywu wynosi zazwyczaj 0.05 do 0,95; w przypadku soczewek olejowych jako medium stosuje się olejek cedrowy, a współczynnik apertury obiektywu może być bliski 1,5.
Długość fali zwykłego światła wynosi {{0}}} nm, więc rozdzielczość mikroskopu nie będzie mniejsza niż 0,2 μm, a rozdzielczość ludzkiego oka wynosi 0,2 mm, więc maksymalne powiększenie ogólnej konstrukcji mikroskopu wynosi zwykle 1000X.
(2) Mikroskopia fluorescencyjna
Niektóre substancje w komórkach, takie jak chlorofil, mogą fluoryzować po naświetleniu promieniami ultrafioletowymi; niektóre substancje same nie mogą fluoryzować, ale jeśli zostaną wybarwione barwnikami fluorescencyjnymi lub przeciwciałami fluorescencyjnymi, mogą również fluoryzować po naświetleniu promieniami ultrafioletowymi, a mikroskop fluorescencyjny (ryc. 2-2, 3, 4) jest jednym z narzędzi do badań jakościowych i ilościowych takich substancji.
Mikroskopy fluorescencyjne i zwykłe mikroskopy mają następujące różnice:
1. Metodą oświetlenia jest zwykle epiluminacja, to znaczy źródło światła jest rzutowane na próbkę przez soczewkę obiektywu (Rysunek 2-3);
2. Źródłem światła jest światło ultrafioletowe, długość fali jest krótsza, a rozdzielczość jest wyższa niż w przypadku zwykłych mikroskopów;
3. Istnieją dwa specjalne filtry, jeden przed źródłem światła służy do filtrowania światła widzialnego, a ten między okularem a soczewką obiektywu służy do filtrowania światła ultrafioletowego w celu ochrony oczu.
(3) Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny
Laserowy konfokalny mikroskop skaningowy (laserowy konfokalny mikroskop skaningowy, rysunek 2-5, 6) wykorzystuje laser jako źródło światła skanującego i skanuje obraz punkt po punkcie, linia po linii, powierzchnia po powierzchni, a skanujący laser i zbiór fluorescencji dzielą soczewka obiektywu, a ognisko soczewki obiektywu jest ogniskiem lasera skanującego jest również punktem obiektowym natychmiastowego obrazowania. Ponieważ długość fali wiązki laserowej jest krótka, a wiązka bardzo cienka, konfokalny laserowy mikroskop skaningowy ma wyższą rozdzielczość, czyli około 3 razy większą niż zwykły mikroskop optyczny. System ogniskuje się raz, a skanowanie ogranicza się do jednej płaszczyzny próbki. Gdy głębokość ogniskowania jest różna, można uzyskać obrazy próbki o różnych poziomach głębi. Te informacje o obrazie są przechowywane w komputerze. Poprzez analizę komputerową i symulację można wyświetlić trójwymiarową strukturę próbki komórek.
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa może być wykorzystywana nie tylko do obserwacji morfologii komórek, ale także do ilościowej analizy wewnątrzkomórkowych składników biochemicznych, statystyki gęstości optycznej oraz pomiaru morfologii komórek.
(4) Mikroskop ciemnego pola
Mikroskop ciemnego pola (mikroskop ciemnego pola, rysunek 2-7) ma warstwę światła pośrodku kondensora, dzięki czemu światło oświetlające nie wpada bezpośrednio do ludzkiej soczewki, a jedynie światło odbite i ugięte przez preparat może wejść do obiektywu, więc tło pola widzenia jest czarne, krawędzie obiektów są jasne. Za pomocą tego mikroskopu można zobaczyć cząsteczki o wielkości 4-200}nm, a rozdzielczość może być 50 razy wyższa niż w przypadku zwykłych mikroskopów.
(5) Mikroskop z kontrastem fazowym
Mikroskop z kontrastem fazowym (mikroskop z kontrastem fazowym, rysunek 2-8, 9) P. Zernike został wynaleziony w 1932 roku i otrzymał za niego Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1953 roku. Największą cechą tego mikroskopu jest możliwość obserwacji niezabarwionych preparatów i żywych komórek.
Podstawową zasadą mikroskopii z kontrastem fazowym jest zmiana różnicy dróg optycznych światła widzialnego przechodzącego przez próbkę na różnicę amplitudy, poprawiając w ten sposób kontrast między różnymi strukturami i czyniąc różne struktury wyraźnie widocznymi. Po przejściu przez próbkę światło ulega załamaniu, odchyleniu od pierwotnej ścieżki optycznej i opóźnieniu o 1/4λ (długość fali). Wzmocnij, zwiększ lub zmniejsz amplitudę, zwiększ kontrast. Pod względem budowy mikroskopy z kontrastem fazowym mają dwie szczególne cechy, które różnią się od zwykłych mikroskopów optycznych:
1. Pierścieniowa przysłona znajduje się między źródłem światła a kondensorem, a jej zadaniem jest spowodowanie, aby światło przechodzące przez kondensor tworzyło pusty stożek świetlny i skupiało się na preparacie.
2. Płytka fazowa (pierścieniowa płytka fazowa) dodaje do soczewki obiektywu płytkę fazową pokrytą fluorkiem magnezu, która może opóźnić fazę światła bezpośredniego lub światła ugiętego o 1/4λ. Istnieją dwa typy:
①Płytka fazy dodatniej: światło bezpośrednie jest opóźnione o 1/4λ. Po połączeniu dwóch grup fal świetlnych, fale świetlne są sumowane, a amplituda jest zwiększana. Struktura preparatu jest jaśniejsza niż otaczające medium, tworząc jasny kontrast (lub kontrast ujemny).
② Płytka fazowa B plus: Ugięte światło jest opóźnione o 1/4λ. Po połączeniu dwóch zestawów promieni fale świetlne są odejmowane, a amplituda zmniejsza się, tworząc ciemny kontrast (lub dodatni kontrast), a struktura jest ciemniejsza niż otaczające medium.
(6) Mikroskop polaryzacyjny
Mikroskop polaryzacyjny służy do wykrywania substancji z dwójłomnością, takich jak włókna, wrzeciona, kolagen, chromosomy i tak dalej. Różnica w stosunku do zwykłych mikroskopów polega na tym, że przed źródłem światła znajduje się polaryzator (polaryzator), dzięki czemu światło wpadające do mikroskopu jest światłem spolaryzowanym, a analizator (polaryzator, którego kierunek polaryzacji jest prostopadły do polaryzatora) znajduje się w tubus obiektywu. Stolik tego mikroskopu można obracać. Kiedy na stoliku umieszcza się substancję o pojedynczym współczynniku załamania światła, bez względu na to, jak stolik jest obrócony, ponieważ dwa polaryzatory są ustawione pionowo, w mikroskopie nie widać światła, a światło nie jest widoczne w mikroskopie. Podczas wchodzenia w materiały dwójłomne obrotowy stolik może wykrywać takie obiekty, ponieważ światło jest odchylane, gdy przechodzi przez takie materiały.
