Zasady mikroskopii konfokalnej
Mikroskop konfokalny to precyzyjny instrument do obrazowania, który pojawił się i rozwinął w latach 80. XX wieku i jest podstawowym instrumentem naukowym do badań struktur submikronowych. Wraz z rozwojem komputerów, oprogramowania do przetwarzania obrazu i laserów, mikroskopy konfokalne również przeszły wielki rozwój i są obecnie szeroko stosowane w dziedzinie biologii, mikrosystemów i pomiarów materiałów. Mikroskop konfokalny to nowy typ mikroskopu łączący zasadę konfokalną, technologię skanowania i technologię przetwarzania grafiki komputerowej. Jego głównymi zaletami są: wysoka rozdzielczość poprzeczna i osiowa oraz skuteczne tłumienie światła rozproszonego, przy wysokim kontraście.
Typowa konfiguracja mikroskopu konfokalnego polega na umieszczeniu dwóch małych otworów na płaszczyźnie sprzężonej płaszczyzny ogniskowej mierzonego obiektu, z których jeden znajduje się przed źródłem światła, a drugi przed detektorem, jak pokazano na rysunku 1. Na rysunku widać, że gdy mierzona próbka znajduje się w płaszczyźnie quasi-ogniskowej, natężenie światła zbierane przez koniec wykrywania jest największe; gdy mierzona próbka znajduje się w pozycji poza ogniskiem, plamka światła na końcu wykrywania rozprasza się, a intensywność światła gwałtownie spada. Dlatego tylko światło emitowane przez punkty na płaszczyźnie ogniskowej może przejść przez otworek wyjściowy, podczas gdy światło emitowane przez punkty poza płaszczyzną ogniskową jest rozogniskowane na wyjściowej płaszczyźnie otworkowej, a większość z nich nie może przejść przez otworek centralny. Dlatego punkt docelowy obserwacji na płaszczyźnie ogniskowej wydaje się jasny, a punkt nieobserwacyjny wydaje się czarny jako tło, zwiększając kontrast i czyszcząc obraz. Podczas procesu obrazowania dwa otwory są konfokalne, punkt konfokalny jest wykrytym punktem, a płaszczyzna, w której znajduje się wykryty punkt, jest płaszczyzną konfokalną.
Wielkość otworu w detektorze w mikroskopii konfokalnej odgrywa kluczową rolę. Ma to bezpośredni wpływ na rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu systemu. Jeśli otwór jest zbyt duży, efekt detekcji konfokalnej nie zostanie osiągnięty, co nie tylko zmniejsza rozdzielczość systemu, ale także wprowadza więcej rozproszonego światła; jeśli otwór jest zbyt mały, zmniejszy to skuteczność wykrywania i zmniejszy obraz mikroskopowy. jasność. Badania wykazały, że gdy średnica otworka jest równa średnicy dysku Airy'ego, wymagania konfokalne są spełnione, a skuteczność detekcji nie jest znacząco zmniejszona. Ponieważ średnica otworka jest na ogół rzędu mikronów, jeśli występuje odchylenie między ogniskiem wiązki laserowej a położeniem otworka, wystąpi zniekształcenie sygnału. Dlatego mikroskopy konfokalne na ogół wykorzystują system autofokusa, który praktycznie wydłuża czas pomiaru.
Ponieważ laserowy konfokalny mikroskop skaningowy jest obrazowaniem punktowym, w celu uzyskania dwuwymiarowego obrazu obiektu konieczne jest zastosowanie skaningu dwuwymiarowego w kierunkach x i y. Różne mikroskopy wykorzystują różne metody skanowania:
(1) Skanowanie obiektów. Oznacza to, że sam obiekt porusza się zgodnie z pewnym prawem, podczas gdy wiązka światła pozostaje niezmieniona. Zalety: stabilny tor optyczny; Wady: wymagany jest duży stół do skanowania, więc prędkość skanowania jest znacznie ograniczona.
(2) System skanowania wiązką jest tworzony za pomocą odblaskowego galwanometru. Oznacza to, że kontrolując galwanometr skanujący, skupiona plamka światła jest regularnie odbijana od określonej warstwy obiektu, aby zakończyć dwuwymiarowe skanowanie. Jego zaletą jest to, że ma wysoką precyzję i jest często używany do pomiarów o wysokiej precyzji. Szybkość skanowania poprawiła się w porównaniu ze skanowaniem obiektów, ale nadal nie jest szybka.
(3) Użyj akustyczno-optycznego elementu odchylającego do skanowania, a skanowanie jest realizowane poprzez zmianę częstotliwości wyjściowej fali dźwiękowej, a następnie zmianę kierunku transmisji fali świetlnej. Jego wyjątkową zaletą jest to, że prędkość skanowania jest bardzo duża. System skanowania opracowany przez Stany Zjednoczone wykorzystuje deflektor akustyczno-optyczny do generowania obrazów wideo w czasie rzeczywistym. Zeskanowanie dwuwymiarowego obrazu zajmuje tylko 1/30 s i prawie osiąga wynik w czasie rzeczywistym.
(4) Skanowanie dysku Nipkowa. Proces skanowania kończy się obracaniem tarczy Nipkowa przy jednoczesnym utrzymaniu innych komponentów w bezruchu. Można go obrazować w jednym czasie, a prędkość jest bardzo duża. Jednakże, ponieważ wiązka obrazu jest światłem pozaosiowym, aberracja pozaosiowa obiektywu musi zostać skorygowana, a stopień wykorzystania energii świetlnej jest bardzo niski.
