Przesuwanie granic mikroskopii superrozdzielczej: mikroskopia samonastawna
Ultraprecyzyjna mikroskopia wykraczająca poza ograniczenia nagrodzonego Nagrodą Nobla mikroskopu o super rozdzielczości umożliwi naukowcom bezpośredni pomiar odległości pomiędzy poszczególnymi cząsteczkami.
Badacze medyczni z Uniwersytetu Nowej Południowej Walii osiągnęli bezprecedensową rozdzielczość w mikroskopii pojedynczych cząsteczek w celu wykrycia interakcji pomiędzy poszczególnymi cząsteczkami w nienaruszonych komórkach.
Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 2014 r. przyznano za rozwój technologii mikroskopii fluorescencyjnej o dużej rozdzielczości, która umożliwiła mikroskopom pierwszy obraz molekularny wnętrza komórki, co zapewnia nowy obraz molekularny złożonych układów i procesów biologicznych.
Teraz granice wykrywalności mikroskopii pojedynczych cząsteczek zostały ponownie przesunięte, a szczegóły opublikowano w najnowszym numerze Science Advances.
Możliwe było obserwowanie i śledzenie poszczególnych cząsteczek za pomocą mikroskopów o ultrawysokiej rozdzielczości, ale interakcje między tymi cząsteczkami zachodzą w skali co najmniej czterokrotnie mniejszej niż skala rozpoznawana przez istniejące mikroskopy jednocząsteczkowe.
„Powodem, dla którego mikroskopy jednocząsteczkowe zwykle charakteryzują się dokładnością lokalizacji wynoszącą około 20–30 nanometrów, jest zazwyczaj fakt, że mikroskop faktycznie porusza się podczas wykrywania sygnałów. Prowadzi to do niepewności. Używając istniejących instrumentów o superrozdzielczości, możemy nie określić, czy dane białko jest związane z innego, ponieważ odległość między nimi jest krótsza niż niepewność co do ich pozycji.”
Aby rozwiązać ten problem, zespół zbudował zautomatyzowaną pętlę sprzężenia zwrotnego wewnątrz mikroskopu jednocząsteczkowego, która wykrywa i ponownie wyrównuje ścieżkę optyczną i stopień zwierciadła.
„Nie ma znaczenia, co zrobisz z tym mikroskopem, po prostu odnajdzie on ścieżkę zwrotną z nanometrową precyzją. To inteligentny mikroskop. Może zrobić wszystko, czego potrzebuje operator lub inżynier serwisowy, i może to zrobić 12 razy na sekundę. " – stwierdził prof. Goss.
Pomiar odległości między białkami
Mając na uwadze konstrukcję i metodologię opisaną w tym artykule, zespół UNSW zaprojektował system sprzężenia zwrotnego, który jest kompatybilny z istniejącymi mikroskopami i zapewnia maksymalną elastyczność w przygotowaniu próbek.
„To bardzo proste i eleganckie rozwiązanie głównego problemu z obrazowaniem. Właśnie zbudowaliśmy mikroskop wewnątrz mikroskopu i jedyne, co zrobiliśmy, to ustawienie głównego mikroskopu. Prostota i praktyczność rozwiązania, które znaleźliśmy, jest jego prawdziwą siłą. sklonuj system i szybko wdrażaj nowe technologie.” – stwierdził prof. Goss.
Aby zademonstrować użyteczność ultraprecyzyjnego jednocząsteczkowego mikroskopu ze sprzężeniem zwrotnym, naukowcy wykorzystali go do bezpośrednich pomiarów odległości między białkami sygnalizacyjnymi w limfocytach T. Powszechnym założeniem w immunologii komórkowej jest to, że te komórki odpornościowe pozostają w stanie spoczynku, gdy receptor komórek T znajduje się blisko innej cząsteczki, która działa jak hamulec.
Ich wysoce precyzyjna mikroskopia wykazała, że w aktywowanych limfocytach T dwie cząsteczki sygnalizacyjne były w rzeczywistości jeszcze bardziej od siebie oddzielone, zwalniając hamulec i włączając sygnalizację receptora limfocytów T.
Prof. Goss powiedział: „Konwencjonalne techniki mikroskopowe nie byłyby w stanie dokładnie zmierzyć tak małej zmiany, ponieważ odległość między cząsteczkami sygnalizacyjnymi w nieaktywnych i aktywowanych limfocytach T różni się tylko o 4-7 nanometrów”.
„Pokazuje to również, jak wrażliwe są te mechanizmy sygnalizacyjne na izolację przestrzenną. Aby zidentyfikować takie procesy regulacyjne, musimy przeprowadzić precyzyjne pomiary odległości, na co pozwala ten mikroskop. Wyniki te pokazują, że technologia jest w fazie odkrywania i nie można jej wyprodukować w żaden sposób. inny sposób."
