Wymagania dotyczące przygotowania próbek do mikroskopii fluorescencyjnej
Wymagania dotyczące przygotowania próbek do mikroskopii fluorescencyjnej
(1) Szklana szkiełko
Grubość szkiełka powinna wynosić 0.8-L2mm. Szkiełko, które jest zbyt grube, z jednej strony pochłonie więcej światła, az drugiej strony nie będzie w stanie skupić światła wzbudzającego na preparacie. Szkiełka muszą być gładkie, jednolitej grubości i wolne od oczywistej autofluorescencji. Czasami stosuje się szkiełka kwarcowe.
(2) Szkło nakrywkowe
Grubość szkiełka nakrywkowego wynosi około 0,17 mm, gładkie. W celu wzmocnienia światła wzbudzającego można również zastosować interferencyjne szkło nakrywkowe, czyli specjalne szkło nakrywkowe pokryte kilkoma warstwami substancji (np. fluorescencja gładka. Światło wzbudzenia przechodzi, a światło wzbudzenia jest odbijane, a to odbite światło wzbudzenia może wzbudzić próbkę.
(3) Próbka
Plastry tkanki lub inne próbki nie powinny być zbyt grube. Jeśli grubość jest zbyt gruba, większość światła wzbudzenia zostanie zużyta w dolnej części preparatu, podczas gdy górna część obserwowana bezpośrednio przez obiektyw nie może być w pełni wzbudzona. Ponadto fluorescencja spowodowana nakładającymi się komórkami lub zanieczyszczeniami, niespecyficzne barwienie tła wpływa na ocenę.
(4) olej lustrzany
Zasadniczo podczas obserwacji preparatów za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych ciemnego pola i olejowych mikroskopów immersyjnych należy stosować olejek immersyjny. Najlepiej używać specjalnego niefluorescencyjnego olejku immersyjnego. Zamiast tego można również użyć gliceryny i ciekłej parafiny, ale współczynnik załamania światła jest niski, co ma niewielki wpływ na jakość obrazu.
Zrozumienie Light Cube mikroskopii fluorescencyjnej
Fluorescencja to światło, które elektrony w substancji pochłaniają energię świetlną ze stanu niskoenergetycznego do stanu wysokoenergetycznego, a następnie uwalniają światło, gdy powraca ono do stanu niskoenergetycznego. Jest to światło wypromieniowane bez temperatury – luminescencja. Oznacza to, że substancja pochłania światło krótkofalowe, wchodzi w stan wzbudzenia i emituje światło długofalowe.
Niezależnie od tego, czy jest to autofluorescencja substancji, barwnika fluorescencyjnego czy białka fluorescencyjnego wyrażanego przez fuzję, musi zostać wzbudzona przez określoną długość fali światła (wzbudzenie). Po migracji elektronów i utracie energii emitują one światło o określonej długości fali (emisja). , które mogą być zbierane przez system wykrywania, aby osiągnąć funkcję identyfikacji specyficznej fluorescencji.
Co to jest fluorescencyjna kostka świetlna?
W obserwacji i obrazowaniu mikroskopu fluorescencyjnego światło wzbudzenia o określonej długości fali i odpowiadające mu światło emisyjne o dużej długości fali są dostarczane przez kostkę światła fluorescencyjnego, dzięki czemu sygnał fluorescencyjny może być zbierany gołym okiem, ekranem wyświetlacza lub kamerą. Dlatego sześcian światła fluorescencyjnego określa, co można wykryć. Kluczowe urządzenie sygnału fluorescencyjnego, jego charakterystyka obejmuje EX: parametry filtra długości fali wzbudzenia, EM: parametry filtra długości fali emisji i DM: parametry lustra dychotomicznego. Weźmy na przykład kostkę DAPI zintegrowanego mikroskopu fluorescencyjnego Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >Światło 425nm może być przesyłane do EM; Filtry emisyjne EM służą do oddzielania fluorescencji emitowanej przez fluorofor od innego tła Elementy optyczne do oddzielania światła. Filtry emisji przepuszczają światło o długości fali fluorescencji przez lustro dichroiczne, blokując jednocześnie wszelkie inne światło, które wycieka ze źródła światła wzbudzenia (odbite od próbki lub optyki). Emitowana długość fali światła jest większa niż obserwowane EM, to znaczy tylko światło w zakresie 450±25nm wchodzi do systemu detekcji. Właściwy dobór filtrów EX, EM i dychotomii DM może pomóc naukowcom osiągnąć wyższy stosunek sygnału do szumu (S/N).
