Różnica między dodatnim i ujemnym kontrastem fazowym w mikroskopie
W zależności od konfiguracji i charakteru pierścienia fazowego umieszczonego w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu próbki można obserwować w dodatnim lub ujemnym kontraście fazowym. Ten interaktywny samouczek bada związek między otoczeniem (S), dyfrakcją (D) i wynikającymi z tego jasnymi cząstkami (falami P), a także dodatnią i ujemną mikroskopią z kontrastem fazowym. Ponadto przedstawiono również geometrię płytki fazowej oraz reprezentatywne obrazy przykładowe.
Kiedy ludzie używają go teraz w swojej pracy, większość badaczy jest w różnicy ujemnej, a teraz różnica pozytywna nie odgrywa większej roli w bieżącej pracy naukowej.
Samouczek inicjuje obraz fazowy z losowo wybraną próbką, która pojawia się w oknie obrazu z kontrastem fazowym, a odpowiednia zależność falowa jest pokazana w lewym sąsiedztwie okna obrazu. Aby obsługiwać samouczek, użyj kursora myszy, aby przesunąć translację między kontrastem fazy dodatniej i ujemnej lub suwakiem trybu kontrastu fazy jasnego oświetlenia. Po przesunięciu suwaka obrazy pojawiające się w oknie obrazu kontrastu fazowego zmieniają wygląd preparatu w bieżącym trybie obrazowania ustawionym suwakiem. Ponadto poniżej wykresu kształtu fali znajduje się płytka fazowa, która zmienia kształt, dopasowując się do trybu obrazowania wybranego przez suwak. Aby wyświetlić nową próbkę, użyj menu rozwijanego Wybrana próbka, aby wybrać inną próbkę.
Wykres konfiguracji płytki fazowej, zależności falowych i wektorów związanych z generowaniem dodatnich i ujemnych obrazów z kontrastem fazowym przedstawiono na rycinie 1. Pokazano również przykłady próbek zobrazowanych tymi technikami. W konfiguracji optycznej z dodatnim kontrastem fazowym (górny rząd obrazu na rysunku 1), czoło fali otaczającej (S) przechodzi przez płytkę fazową, co skutkuje przesunięciem fazowym netto o 180 stopni, o 1/4 długości fali ( 1 połowa długości fali). Zaawansowane fronty fal przestrzennych mogą teraz uczestniczyć w destrukcyjnej interferencji z falami dyfrakcyjnymi (D) na pośredniej płaszczyźnie obrazu. W większości przypadków samo przesunięcie względnej fazy otaczającego czoła fali nie wystarcza do wygenerowania obrazów o wysokim kontraście w mikroskopach firmy Nikon. Dzieje się tak, ponieważ amplituda fal otaczających jest znacznie większa niż amplituda fal ugiętych i tłumi wynikowy obraz wytwarzany przez interferencję z ułamka całkowitej liczby fal. Aby zredukować otaczające czoło fali do wartości bliższej amplitudzie fal dyfrakcyjnych (i wykonać interferencję w płaszczyźnie obrazu), nieprzezroczystość w pierścieniu fazowym obiektywu uzyskuje się poprzez zastosowanie półprzeźroczystego metalu (neutralny wzrost gęstości ) powłoka Podłoga. Otaczające fale świetlne, które zgodnie z projektem przechodzą prawie całkowicie przez pierścień fazowy, pod mikroskopem z kontrastem fazowym, mają znacznie zmniejszoną amplitudę przez nieprzezroczystość płytki fazowej do wartości w zakresie od 10 do 30 procent pierwotnej intensywności.
Ponieważ wynikowa fala cząsteczkowa jest wytwarzana przez interferencję* otaczających i ugiętych frontów falowych, amplituda fali cząsteczkowej (P) wytwarzanej przez interferencję między frontami falowymi docierającymi do płaszczyzny obrazu jest teraz znacznie mniejsza niż otaczająca w trybie Seksualnym nałożona powłoka gęstości. Efekt netto polega na przekształceniu względnej różnicy faz wprowadzonej przez przejście światła wychodzącego z płaszczyzny obrazu przez próbkę na różnicę amplitudy (intensywności). Ponieważ ludzkie oko zinterpretuje różnicę w intensywności jako kontrast, preparat jest teraz widoczny w okularze mikroskopu i można go również uchwycić na membranie za pomocą konwencjonalnych systemów kamer lub cyfrowo za pomocą urządzeń CCD lub CMOS. Wszystkie systemy z dodatnim kontrastem fazowym selektywnie przesuwają fazę czoła fali liniowego otaczającego (S) względem sferycznego czoła fali ugiętej (D). Próbki o wyższym współczynniku załamania światła niż otaczające je medium wydają się ciemniejsze na neutralnym szarym tle, podczas gdy te o niższym współczynniku załamania niż w pływającym ośrodku wydają się jaśniejsze niż na szarym tle.
Aby zmodyfikować przestrzenną separację ugiętych frontów falowych otaczających fazę i amplitudę w układzie optycznym z kontrastem fazowym, wprowadzono szereg konfiguracji płytek fazowych. Ponieważ płytka fazowa znajduje się na lub bardzo blisko tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu (płaszczyzny dyfrakcji), całe światło przechodzące przez mikroskop musi przechodzić przez ten element. Część płytki fazowej w ognisku pierścieniowym kondensatora nazywana jest obszarem sprzężonym, podczas gdy pozostały obszar nazywany jest obszarem komplementarnym. Obszar sprzężony zawiera materiał odpowiedzialny za zmianę fazy otaczającego (nieugiętego) światła o plus lub minus 90 stopni w stosunku do ugiętego czoła fali. Ogólnie rzecz biorąc, obszar pierścienia sprzężonego z fazą jest szerszy (około 25 procent) niż obszar określony przez obraz pierścienia kondensującego, aby zmniejszyć ilość otaczającego światła, które rozchodzi się do obszaru komplementarnego.
Większość płytek fazowych dostępnych u współczesnych producentów mikroskopów to płytki przygotowane przez osadzanie próżniowe cienkich warstw dielektrycznych i metalicznych na płytce szklanej lub montowane bezpośrednio na powierzchni soczewki obiektywu mikroskopu. Rolą filmu dielektrycznego jest fazowanie światła, podczas gdy film metalowy osłabia intensywność światła nieugiętego. Niektórzy producenci stosują wiele powłok antyrefleksyjnych w połączeniu z folią, aby zmniejszyć ilość odblasków i odbić światła rozproszonego z powrotem do układu optycznego. Jeśli płytka fazowa nie jest utworzona na powierzchni soczewki, jest zwykle sklejona między kolejnymi soczewkami, które znajdują się na płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu tylnej części obiektywu. Grubość i współczynnik załamania światła powłok dielektrycznych, metalowych i przeciwodblaskowych, jak również cementu optycznego, są starannie dobierane w celu uzyskania pożądanego przesunięcia fazowego między komplementarnymi i sprzężonymi obszarami płytki fazowej. Pod względem optycznym płytka fazowa, która zmienia fazę względem otaczającego światła, aby ugiąć światło o 90 stopni (dodatnio lub ujemnie), nazywana jest płytką ćwierćfalową ze względu na wpływ na nią różnicy dróg optycznych.
Przegląd odwrotności fazy dodatniej pokazano na rysunku 1. Płytka kontrastowa fazy dodatniej (lewa strona rysunku 1) napędza falę otaczającą o 1/4 długości fali, dzięki pierścieniowi erozji w szklanej płytce, który może zostać zmniejszona przez górne przejście w płycie o wysokim indeksie. Przebyta ścieżka fizyczna fali. Ze względu na interakcję z próbką, gdy ugięte promienie próbki (D) są opóźnione, różnica dróg optycznych między falami otaczającymi i ugiętymi, które wychodzą z płytki fazowej, wynosi połowę długości fali na 1/4 długości fali. Rezultatem jest różnica dróg optycznych o 180- stopni między falami otaczającymi i ugiętymi, co skutkuje destrukcyjną interferencją dla próbek o wysokim współczynniku załamania światła między płaszczyznami obrazu. Krzywa amplitudy dla fazy dodatniej przeciwnej do niszczącej fali interferencyjnej jest pokazana na górnym wykresie rysunku 1. Wynikowa fala cząstek (P) ma niższą amplitudę niż fala otaczająca (S), przez co obiekt wydaje się w porównaniu ze stosunkowo ciemniejsze tło. Na dole zdjęcie zielonych alg Zygnema pokazanych po prawej stronie (oznaczone jako DL). Wektor reprezentowany przez postęp 1/4 długości fali, który jest pokazany jako 90- stopni obracającej się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara fali otaczającej z dodatnim kontrastem fazowym, pojawia się między rysunkiem a obrazem na rysunku 1.
Alternatywnie, optykę mikroskopu można również wytworzyć tak, aby wytwarzała przeciwną fazę ujemną, jak pokazano w dolnej części rysunku 1, w którym to przypadku fale otaczające (S) są opóźnione (a nie przyspieszone) o ćwierć długości fali względem jedna fala dyfrakcyjna (D). W rezultacie próbki o wysokich współczynnikach załamania światła wydają się jaśniejsze na ciemniejszym szarym tle (patrz dolny obraz oznaczony BM na rycinie 1). W przeciwnej fazie fazowej obiektywna płytka fazowa zawiera wypukły pierścień, który opóźnia fazę (zamiast przesuwać fazę jako przeciwną fazę dodatnią), przechodząc przez ćwierć długości fali w stosunku do fazy ugiętej fali jako fali otaczającej zerowego rzędu. Ponieważ ugięte fale zostały opóźnione o ćwierć długości fali, gdy przechodzą przez próbkę, różnica dróg optycznych między falami otaczającymi i ugiętymi jest wyeliminowana, a próbka o wysokim współczynniku załamania światła konstruktywnie interferuje na płaszczyźnie obrazu. Należy zauważyć, że wynikowa fala cząstek (P) ma większą amplitudę niż fala otaczająca (S) w ujemnym kontraście fazowym. Pokazano również ujemną fazę odwróconą, w której wektor fali opłynięcia przechodzi przez obrót diagramu wektorowego o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
