Główną metodą obserwacyjną mikroskopu optycznego jest obserwacja fluorescencyjna
Fluorescencja odnosi się do procesu, w którym substancja fluorescencyjna emituje światło o większej długości fali prawie jednocześnie, gdy jest napromieniowana światłem o określonej długości fali (Rysunek 1). Kiedy światło o określonej długości fali (długość fali wzbudzenia) uderza w cząsteczkę, na przykład w fluoroforze, energia fotonu jest pochłaniana przez elektrony cząsteczki. Następnie elektrony przechodzą ze stanu podstawowego (S0) na wyższy poziom energetyczny, stan wzbudzony (S1'). Ten proces nazywa się wzbudzeniem①. Elektron pozostaje w stanie wzbudzonym przez 10-9–10-8 sekund, podczas których elektron traci część energii②. Podczas procesu opuszczania przez elektrony stanu wzbudzonego (S1) i powracania do stanu podstawowego③ uwalniana jest pozostała energia pochłonięta w procesie wzbudzenia.
Czas przebywania cząsteczki fluorescencyjnej w stanie wzbudzonym to czas życia fluorescencji, który ogólnie mieści się na poziomie nanosekund i jest nieodłączną cechą samej cząsteczki fluorescencyjnej. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), które wykorzystuje technologię obrazowania czasu życia fluorescencji, nazywa się obrazowaniem czasu życia fluorescencji (FLIM). Oprócz obrazowania intensywności fluorescencji można uzyskać bardziej dogłębne funkcjonalne i dokładne pomiary w celu uzyskania konformacji molekularnej, interakcji międzycząsteczkowych i mikrośrodowiska cząsteczek. Informacje trudne do uzyskania za pomocą konwencjonalnego obrazowania optycznego.
Inną ważną właściwością fluorescencji jest przesunięcie Stokesa, czyli różnica długości fali między pikami wzbudzenia i emisji (Rysunek 2). Zazwyczaj długość fali emisji jest dłuższa niż długość fali wzbudzenia. Dzieje się tak, ponieważ elektrony tracą część swojej energii w procesie relaksacji po wzbudzeniu substancji fluorescencyjnej i przed uwolnieniem fotonów. Substancje fluorescencyjne z większymi przesunięciami Stokesa są łatwiejsze do zaobserwowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Mikroskopia fluorescencyjna i kostki z filtrem fluorescencyjnym
Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop optyczny, który wykorzystuje właściwości fluorescencyjne do obserwacji i obrazowania i jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach, takich jak biologia komórki, neurobiologia, botanika, mikrobiologia, patologia i genetyka. Obrazowanie fluorescencyjne ma zalety wysokiej czułości i wysokiej specyficzności i jest bardzo odpowiednie do obserwacji rozmieszczenia określonych białek i organelli w tkankach i komórkach, badania kolokalizacji i interakcji, śledzenia dynamicznych procesów życiowych, takich jak zmiany stężenia jonów itp.
Większość cząsteczek w komórkach nie fluoryzuje i aby je zobaczyć, muszą być oznakowane fluorescencyjnie. Istnieje wiele metod znakowania fluorescencyjnego, takich jak znakowanie bezpośrednie (takie jak użycie DAPI do znakowania DNA) lub barwienie immunologiczne przy użyciu właściwości przeciwciał wiążących antygen lub użycie białek fluorescencyjnych (takich jak GFP, białko zielonej fluorescencji) do znakowania białek docelowych i odwracalne wiązanie. Barwniki syntetyczne (takie jak Fura-2) i tak dalej.
Obecnie mikroskop fluorescencyjny stał się standardowym wyposażeniem różnych laboratoriów i platform obrazowania i jest dobrym pomocnikiem w naszych codziennych eksperymentach. Mikroskopy fluorescencyjne dzielą się głównie na trzy kategorie: pionowe mikroskopy fluorescencyjne (nadające się do krojenia), odwrócone mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do żywych komórek, z uwzględnieniem krojenia), stereoskopy fluorescencyjne (odpowiednie do większych okazów, takich jak rośliny, danio pręgowany (dorosły/zarodek ), medaka, narządy myszy/szczura itp.).
Blok filtra fluorescencyjnego jest podstawowym elementem obrazowania fluorescencyjnego mikroskopu. Składa się z trzech części: filtra wzbudzenia, filtra emisji i rozdzielacza wiązki dichroicznej. Jest zainstalowany w kole filtrowym. Na przykład Leica DMi8 jest wyposażona w 6-pozycyjne koło filtrowe (rys. 3). Liczba pozycji różnych kół mikroskopu będzie różna, a niektóre mikroskopy używają szkiełek blokowych filtrów.
Blok filtra odgrywa ważną rolę w obrazowaniu fluorescencyjnym: filtr wzbudzenia wybiera światło wzbudzające do wzbudzenia próbki i blokuje światło o innych długościach fal; światło przechodzące przez filtr wzbudzenia przechodzi przez lustro dichroiczne (jego funkcją jest odbijanie światła wzbudzenia i przepuszczanie fluorescencji), po odbiciu jest skupiane przez soczewkę obiektywu, naświetla próbkę i wzbudza odpowiednią fluorescencję, czyli , emitowane światło. Emitowane światło jest zbierane przez soczewkę obiektywu, przechodzi przez dichroiczny rozdzielacz wiązki i dociera do filtra emisyjnego. Jak pokazano na rysunku 4: długość fali wzbudzenia wynosi 450-490nm, zwierciadło dichroiczne odbija światło krótsze niż 510nm, przepuszcza światło dłuższe niż 510nm, a zakres odbioru emitowanego światła wynosi 520-560nm.
