Zrozumienie konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
Podstawowa zasada konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej: Użyj punktowego źródła światła do oświetlenia próbki, aby utworzyć małą, dobrze odgraniczoną plamkę świetlną w płaszczyźnie ogniskowej. Fluorescencja emitowana przez plamkę po oświetleniu jest zbierana przez soczewkę obiektywu i zwracana do zwierciadła dichroicznego wzdłuż pierwotnej ścieżki światła. stanowią rozdzielacz wiązki. Spektrometr wysyła fluorescencję bezpośrednio do detektora. Przed źródłem światła i detektorem znajduje się dziurka, nazywana odpowiednio dziurką oświetlającą i dziurką detekcyjną. Wymiary geometryczne obu są spójne i wynoszą około 100-200nm; w stosunku do punktu świetlnego w płaszczyźnie ogniskowej są one sprzężone, co oznacza, że punkt świetlny przechodzi przez szereg soczewek i ostatecznie może zostać skupiony jednocześnie na otworku oświetlającym i otworku detekcyjnym. W ten sposób światło z płaszczyzny ogniskowej może być skupione w zasięgu otworu detekcyjnego, natomiast światło rozproszone znad lub spod płaszczyzny ogniskowej jest blokowane na zewnątrz otworu detekcyjnego i nie można go zobrazować. Próbka jest skanowana punkt po punkcie za pomocą lasera, a fotopowielacz znajdujący się za otworkiem detekcyjnym również uzyskuje obraz konfokalny odpowiedniego punktu świetlnego punkt po punkcie, który jest przetwarzany na sygnał cyfrowy i przesyłany do komputera, a następnie agregowany na na ekranie w wyraźny obraz konfokalny całej płaszczyzny ogniskowej. .
Każdy obraz płaszczyzny ogniskowej jest w rzeczywistości optycznym przekrojem poprzecznym próbki. Ten przekrój optyczny ma zawsze określoną grubość i nazywany jest również cienkim przekrojem optycznym. Ponieważ natężenie światła w ognisku jest znacznie większe niż natężenie światła w miejscu nieogniskowym, a nieogniskowe światło płaskie jest filtrowane przez dziurkę, głębia ostrości układu konfokalnego wynosi w przybliżeniu zero. Skanowanie wzdłuż kierunku osi Z może zrealizować tomografię optyczną, tworząc pożądaną. Obserwuj dwuwymiarowy przekrój optyczny w skupionym miejscu próbki. Łącząc skanowanie w płaszczyźnie XY (płaszczyzny ogniskowej) ze skanowaniem w osi Z (osi optycznej), gromadząc ciągłe poziomy obrazów dwuwymiarowych i przetwarzając je za pomocą specjalistycznego oprogramowania komputerowego, można uzyskać trójwymiarowy obraz próbki.
Oznacza to, że dziurka detekcyjna i dziurka źródła światła są zawsze skupione w tym samym punkcie, tak że fluorescencja wzbudzona poza płaszczyzną ogniskowania nie może przedostać się do dziurki detekcyjnej.
Prostym wyrażeniem zasady działania lasera konfokalnego jest to, że wykorzystuje on laser jako źródło światła. W oparciu o tradycyjne obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego dodano laserowe urządzenie skanujące i sprzężone urządzenie ogniskujące, a systemem steruje komputer w celu gromadzenia i przetwarzania obrazów cyfrowych.
