Do czego służy mikroskop konfokalny?
1. Po staraniach i ulepszeniach naszych wielkich poprzedników mikroskop optyczny osiągnął punkt doskonałości. W rzeczywistości zwykłe mikroskopy mogą w prosty i szybki sposób zapewnić nam piękne obrazy mikroskopowe. Jednak wydarzyło się wydarzenie, które wniosło rewolucyjną innowację do tego niemal idealnego świata mikroskopów, jakim jest wynalezienie „laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego”. Cechą tego nowego typu mikroskopu jest to, że przyjmuje system optyczny, który wyodrębnia informacje o obrazie tylko na powierzchni, na której koncentruje się ostrość, i przywraca uzyskane informacje w pamięci obrazu podczas zmiany ostrości, dzięki czemu można uzyskać pełne informacje 3D uzyskany. Surowy obraz inteligencji. Dzięki tej metodzie można łatwo uzyskać informacje o kształcie powierzchni, których nie można potwierdzić zwykłym mikroskopem. Ponadto w przypadku zwykłych mikroskopów optycznych „zwiększanie rozdzielczości” i „pogłębianie głębi ostrości” są warunkami sprzecznymi, zwłaszcza przy dużych powiększeniach, ta sprzeczność jest bardziej widoczna, ale w przypadku mikroskopów konfokalnych problem ten można łatwo rozwiązać.
2. Zalety konfokalnego układu optycznego
Schemat ideowy laserowego mikroskopu konfokalnego
Konfokalny układ optyczny dokonuje naświetlania punktowego próbki, a światło odbite odbierane jest również przez receptor punktowy. Kiedy próbka jest ustawiona w ognisku, prawie całe odbite światło może dotrzeć do fotoreceptora, a gdy próbka jest nieostra, odbite światło nie może dotrzeć do fotoreceptora. Oznacza to, że w konfokalnym układzie optycznym na wyjściu pojawi się tylko obraz pokrywający się z ogniskiem, a plamki świetlne i bezużyteczne światło rozproszone zostaną osłonięte.
3. Dlaczego warto używać lasera?
W konfokalnym układzie optycznym próbka jest oświetlana w jednym punkcie, a odbite światło jest również odbierane przez punktowy fotoreceptor. Dlatego konieczne staje się punktowe źródło światła. Lasery są bardzo punktowymi źródłami światła. W większości przypadków laserowe źródła światła są wykorzystywane jako źródła światła w mikroskopach konfokalnych. Ponadto właściwości monochromatyczności, kierunkowości i doskonałego kształtu wiązki lasera są również ważnymi przesłankami jego szerokiego zastosowania.
4. Możliwa staje się obserwacja w czasie rzeczywistym oparta na szybkim skanowaniu
W przypadku skanowania laserowego w kierunku poziomym używana jest aktywowana akustycznie jednostka odchylania optycznego (akustyczny deflektor optyczny, element AO), aw kierunku pionowym stosowane jest lustro Servo Galvano. Ponieważ akustyczno-optyczna jednostka odchylająca nie ma mechanicznej części wibracyjnej, może wykonywać szybkie skanowanie i obserwację w czasie rzeczywistym na ekranie monitora. To szybkie obrazowanie jest bardzo ważnym elementem, który bezpośrednio wpływa na szybkość ustawiania ostrości i przywracania pozycji.
5. Związek między położeniem ostrości a jasnością
W konfokalnym systemie optycznym jasność próbki jest maksymalna, gdy próbka jest prawidłowo umieszczona w ognisku, a jej jasność gwałtownie spada przed i po niej (linia ciągła na rysunku 4). Czuła selektywność płaszczyzny ogniskowej jest również zasadą określania kierunku wysokości mikroskopu konfokalnego i rozszerzania ogniskowej. Natomiast zwykłe mikroskopy optyczne nie mają znaczących zmian jasności przed i po ustawieniu ostrości.
6. Wysoki kontrast, wysoka rozdzielczość
W zwykłych mikroskopach optycznych, w wyniku interferencji światła odbitego od części skupiającej, zachodzi ona na część ogniskującą obrazującą, co powoduje spadek kontrastu obrazu. Z drugiej strony, w konfokalnym układzie optycznym, światło rozproszone poza ogniskiem i światło rozproszone wewnątrz soczewki obiektywu są prawie całkowicie usuwane, dzięki czemu można uzyskać obraz o bardzo wysokim kontraście. Ponadto, ponieważ światło przechodzi przez obiektyw dwukrotnie, obraz punktowy jest najpierw wyostrzany, co również poprawia zdolność rozdzielczą mikroskopu.
7. Funkcja lokalizacji optycznej
W konfokalnym układzie optycznym światło odbite poza punktem pokrywającym się z ogniskiem jest zasłaniane przez mikropory. Dlatego podczas obserwacji trójwymiarowej próbki obraz powstaje tak, jakby próbka była przecięta płaszczyzną ogniskową (Rysunek 5). Efekt ten jest znany jako lokalizacja optyczna i jest jedną ze specjalności konfokalnych systemów optycznych.
8. Skoncentruj funkcję pamięci mobilnej
Tak zwane światło odbite poza ogniskiem jest osłonięte przez mikropory. Z drugiej strony można uznać, że wszystkie punkty na obrazie utworzonym przez konfokalny układ optyczny pokrywają się z ogniskiem. Dlatego, jeśli trójwymiarowa próbka zostanie przesunięta wzdłuż osi Z (osi optycznej), obrazy są gromadzone i przechowywane w pamięci, a ostatecznie uzyskany zostanie obraz utworzony przez całą próbkę i ognisko. Funkcja nieskończonego pogłębiania głębi ostrości w ten sposób nazywana jest funkcją pamięci mobilnej.
9. Funkcja pomiaru kształtu powierzchni
Jeśli chodzi o funkcję przesuwania ogniska, kształt powierzchni próbki można zmierzyć w sposób bezkontaktowy, dodając obwód rejestrujący wysokość powierzchni. Na podstawie tej funkcji można zapisać współrzędne osi Z utworzone przez maksymalną wartość luminancji w każdym pikselu, a na podstawie tych informacji można uzyskać informacje związane z kształtem powierzchni próbki.
10. Precyzyjna funkcja pomiaru mikrorozmiarów
Jednostka odbierająca światło jest wyposażona w 1-wymiarowy czujnik obrazowania CCD, więc nachylenie urządzenia skanującego nie ma na nią wpływu, dzięki czemu można przeprowadzić bardzo precyzyjny pomiar. Dodatkowo dzięki zastosowaniu funkcji pamięci przesunięcia ostrości z możliwością regulacji głębi ostrości (pogłębiania) można wyeliminować błąd pomiaru spowodowany przesunięciem ostrości.
11. Trójwymiarowa analiza obrazu
Korzystając z funkcji pomiaru kształtu powierzchni, można łatwo stworzyć trójwymiarowy obraz powierzchni próbki. Nie tylko to, ale także może wykonywać różnorodne analizy, takie jak: pomiar chropowatości powierzchni, powierzchnia, objętość, pole powierzchni, kołowość, promień, maksymalna długość, obwód, środek ciężkości, obraz tomograficzny, transformacja FFT, pomiar szerokości linii itp. .
Laserowy konfokalny mikroskop skaningowy może być wykorzystywany nie tylko do obserwacji morfologii komórek, ale także do ilościowej analizy wewnątrzkomórkowych składników biochemicznych, statystyki gęstości optycznej oraz pomiaru morfologii komórek.
