Co to jest dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna
Podstawowa zasada wzbudzenia dwufotonowego jest następująca: w przypadku dużej gęstości fotonów cząsteczki fluorescencyjne mogą jednocześnie absorbować dwa fotony o dużej długości fali i emitować foton o mniejszej długości fali po krótkim okresie tzw. życia stanu wzbudzonego . ; efekt jest taki sam, jak użycie fotonu, którego długość fali jest równa połowie długości fali długiej, do wzbudzenia cząsteczki fluorescencyjnej. Wzbudzenie dwufotonowe wymaga dużej gęstości fotonów. Aby nie uszkodzić komórek, mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje wysokoenergetyczne lasery impulsowe z synchronizacją modów. Laser emitowany przez ten laser ma wysoką energię szczytową i niską energię średnią, jego szerokość impulsu wynosi zaledwie 100 femtosekund, a jego częstotliwość może sięgać od 80 do 100 megaherców. Gdy do ogniskowania fotonów lasera impulsowego używana jest soczewka obiektywu o dużej aperturze numerycznej, gęstość fotonów w ognisku soczewki obiektywu jest najwyższa, a wzbudzenie dwufotonowe występuje tylko w ognisku soczewki obiektywu, więc mikroskop dwufotonowy nie potrzebuje konfokalnego otworka, co poprawia skuteczność detekcji fluorescencji.
Ogólnie zjawisko fluorescencji, ze względu na małą gęstość fotonów światła wzbudzającego, cząsteczka fluorescencyjna może absorbować tylko jeden foton w tym samym czasie, a następnie emitować foton fluorescencyjny poprzez przejście radiacyjne, czyli fluorescencję pojedynczego fotonu. W procesie wzbudzania fluorescencji z wykorzystaniem lasera jako źródła światła może wystąpić fluorescencja dwufotonowa lub nawet wielofotonowa. W tym czasie natężenie zastosowanego źródła światła wzbudzającego jest duże, a gęstość fotonów spełnia wymagania cząsteczek fluorescencyjnych pochłaniających jednocześnie dwa fotony. W procesie wykorzystania ogólnego lasera jako źródła światła wzbudzającego gęstość fotonów wciąż nie jest wystarczająca do wytworzenia zjawiska absorpcji dwufotonowej. Zwykle stosuje się laser impulsowy femtosekundowy, a jego chwilowa moc może sięgać rzędu megawatów. Dlatego długość fali fluorescencji dwufotonowej jest krótsza niż długość fali światła wzbudzającego, co jest równoważne efektowi wywołanemu przez wzbudzenie przy połowie długości fali wzbudzenia.
