Dlaczego muszę używać mikroskopu konfokalnego?
1. Mikroskop optyczny został udoskonalony dzięki wysiłkom i ulepszeniom naszych wielkich poprzedników. Tak naprawdę zwykły mikroskop może łatwo i szybko dostarczyć nam pięknych obrazów mikroskopowych. Jednak wydarzeniem, które zrewolucjonizowało świat niemal doskonałych mikroskopów, było wynalezienie „laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego”. Ten nowy typ mikroskopu charakteryzuje się układem optycznym, który wydobywa informację o obrazie jedynie z powierzchni, na której skupiona jest ostrość, a zmieniając ostrość przy jednoczesnym odtwarzaniu pozyskanych informacji w pamięci obrazu, możliwe jest uzyskanie ostrego obrazu z pełne informacje 3-wymiarowe. W ten sposób można łatwo uzyskać informacje o kształcie powierzchni, których nie da się potwierdzić za pomocą konwencjonalnego mikroskopu. Ponadto, chociaż „zwiększanie rozdzielczości” i „pogłębianie głębi ostrości” są sprzecznymi warunkami dla konwencjonalnych mikroskopów optycznych, szczególnie przy dużych powiększeniach, problem ten rozwiązują mikroskopy konfokalne.
2. Zalety konfokalnego układu optycznego
Schemat ideowy laserowego mikroskopu konfokalnego
Konfokalny układ optyczny polega na punktowym oświetleniu próbki, natomiast światło odbite odbierane jest również za pomocą receptora punktowego. Kiedy próbkę umieszcza się w ognisku, prawie całe odbite światło dociera do fotoreceptora, a gdy próbka jest nieostra, odbite światło nie może dotrzeć do fotoreceptora. Innymi słowy, w konfokalnym układzie optycznym wysyłany jest tylko obraz pokrywający się z ogniskiem, a plamy i niepotrzebne rozproszone światło są blokowane.
3. Dlaczego warto używać lasera?
W konfokalnym układzie optycznym próbka jest oświetlana punktowo, a odbite światło jest odbierane przez czujnik punktowy. Dlatego konieczne jest punktowe źródło światła. Lasery są w dużej mierze punktowym źródłem światła. W większości przypadków źródłem światła dla mikroskopów konfokalnych jest źródło światła laserowego. Ponadto monochromatyczność, kierunkowość i doskonały kształt wiązki laserów to ważne powody ich powszechnego zastosowania.
4. Możliwa jest obserwacja w czasie rzeczywistym w oparciu o szybkie skanowanie.
Do skanowania laserowego w kierunku poziomym stosuje się akustyczną jednostkę odchylającą optykę (Acoustic Optical Deflector, AO prime), a w kierunku pionowym stosuje się serwoelektronicznie sterowane lustro skanujące wiązką (Servo Galvano-mirror). Ponieważ w deflektorze AO nie występują wibracje mechaniczne, możliwe jest szybkie skanowanie i obserwacja na ekranie monitora w czasie rzeczywistym. Wysoka prędkość tej kamery jest bardzo ważnym elementem, który bezpośrednio wpływa na szybkość ustawiania ostrości i wyszukiwania pozycji.
5. Związek między pozycją ostrości a jasnością
W konfokalnym układzie optycznym próbka jest prawidłowo umieszczona w pozycji ogniskowej, gdy jasność jest zui duża, przed i za nią jej jasność będzie gwałtownie zmniejszona (rysunek 4 linia ciągła). Ta czuła selektywność płaszczyzny ogniskowej jest zasadą leżącą u podstaw orientacji wysokościowej mikroskopu konfokalnego i ekspansji głębi ostrości. Natomiast zwykłe mikroskopy optyczne nie wykazują żadnej znaczącej zmiany jasności przed i po położeniu ogniskowej (linia przerywana na ryc. 4).
6. Wysoki kontrast, wysoka rozdzielczość
W konwencjonalnym mikroskopie optycznym światło odbite z nieostrej części mikroskopu zakłóca i nakłada się na ogniskową część mikroskopu obrazującą, co powoduje zmniejszenie kontrastu obrazu. Natomiast w konfokalnym układzie optycznym rozproszone światło na zewnątrz ogniska i wewnątrz obiektywu jest prawie całkowicie usuwane, co skutkuje obrazami o bardzo wysokim kontraście. Dodatkowo poprawia się zdolność rozdzielcza mikroskopu, ponieważ światło przechodzi przez obiektyw dwukrotnie, wyostrzając obraz punktowy.
7. Funkcja lokalizacji optycznej
W konfokalnym układzie optycznym odbite światło jest osłonięte przez mikroaperturę w punkcie innym niż ognisko. W rezultacie, obserwując trójwymiarową próbkę, obraz powstaje tak, jakby próbka została przecięta ogniskiem (ryc. 5). Efekt ten nazywany jest lokalizacją optyczną i jest jedną z cech konfokalnych układów optycznych.
