Oznaczanie liczby mikroorganizmów-Mikroskopowa metoda bezpośredniego liczenia!
Wzrost populacji bakterii objawia się wzrostem liczby komórek lub wzrostem materiału komórkowego. Metody określania liczby komórek obejmują bezpośrednie zliczanie mikroskopowe, zliczanie płytek, ocenę zmętnienia za pomocą spektrofotometru, najbardziej prawdopodobną liczbę MPN i filtrację membranową. (filtracja membranowa) itp. Metody pomiaru substancji komórkowych obejmują oznaczanie suchej masy komórek, oznaczanie niektórych składników komórek, takich jak zawartość azotu, zawartość RNA i DNA oraz oznaczanie produktów metabolitów. Krótko mówiąc, istnieje wiele metod pomiaru wzrostu drobnoustrojów, każda ma swoje zalety i wady. Metodę należy dobrać w zależności od konkretnych wymagań pracy. Eksperyment ten wprowadza głównie metodę bezpośredniego liczenia mikroskopowego, która jest powszechnie stosowana w pracach produkcyjnych i badawczych.
1. Wymagania dotyczące celu
1. Wyjaśnij zasadę liczenia za pomocą tablicy do liczenia krwinek.
2. Opanuj metodę liczenia mikroorganizmów przy użyciu tablicy do liczenia krwinek.
2. Podstawowe zasady
Mikroskopowa metoda liczenia bezpośredniego jest prostą, szybką i intuicyjną metodą, polegającą na umieszczeniu niewielkiej ilości zawiesiny badanej próbki na specjalnym szkiełku o określonej powierzchni i objętości (zwanym także bakteriometrem) i zliczeniu jej bezpośrednio pod mikroskopem. Metody. Obecnie do powszechnie stosowanych bakteriometrów w kraju i za granicą należą: hemocytometr, bakteriometr Peteroffa-Hausera, bakteriometr Hawksleya itp. Wszystkie mogą być używane do liczenia drożdży, bakterii, zarodników pleśni i innych zawiesin, a podstawowe zasady są takie same. Dwa ostatnie liczniki bakterii mają całkowitą objętość 0.02 mm3 po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, a odległość między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem wynosi tylko 0,02 mm. Dlatego do obserwacji i wykrywania mniejszych komórek, takich jak bakterie, można używać obiektywu immersyjnego w oleju. liczyć. Oprócz stosowania tych bakteriometrów istnieje również metoda szacowania, która bezpośrednio obserwuje pod mikroskopem stosunek powierzchni rozmazu do pola widzenia. Metodę tę powszechnie stosuje się do badania bakteriologicznego mleka. Zaletami metody liczenia bezpośredniego przez mikroskop jest to, że jest ona intuicyjna, szybka i łatwa w obsłudze. Wadą tej metody jest jednak to, że zmierzony wynik jest zazwyczaj sumą bakterii martwych i bakterii żywych. Obecnie istnieją pewne metody przezwyciężenia tego niedociągnięcia, takie jak łączenie żywych bakterii barwiących hodowlę w mikrokomorze (krótki czas) i dodawanie inhibitorów podziału komórek w celu osiągnięcia celu polegającego na zliczaniu wyłącznie żywotnych bakterii.
W tym eksperymencie jako przykład wykorzystano hemocytometr do bezpośredniego zliczania pod mikroskopem. Informacje na temat stosowania pozostałych dwóch bakteriometrów można znaleźć w instrukcjach każdego producenta. Powszechnie stosowaną metodą liczenia drobnoustrojów jest bezpośrednie zliczanie pod mikroskopem przy użyciu hemocytometru. Tablica licząca to specjalna prowadnica z czterema rowkami tworzącymi trzy platformy; szersza platforma pośrodku jest podzielona na dwie połowy krótkim poziomym rowkiem, a po obu stronach platformy znajduje się kratka. Każda kwadratowa siatka jest podzielona na dziewięć dużych kwadratów, a duży kwadrat pośrodku to pomieszczenie do liczenia. Strukturę tablicy do liczenia krwinek pokazano na rysunku {{0}}. Generalnie istnieją dwie specyfikacje skali komory zliczającej. Jeden to duży kwadrat podzielony na 25 średnich kwadratów, a każdy średni kwadrat jest podzielony na 16 małych kwadratów (rysunek 15-2); drugi to duży kwadrat. Kwadratowa siatka jest podzielona na 16 średnich kwadratów, a każdy średni kwadrat jest podzielony na 25 małych kwadratów. Jednakże niezależnie od rodzaju planszy do liczenia, w każdym większym kwadracie znajduje się 400 małych kwadratów. Długość boku każdego dużego kwadratu wynosi lmm, a powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi lmm2. Po zakryciu szkiełka nakrywkowego wysokość pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem wynosi 0,1 mm, zatem objętość komory zliczającej wynosi 0,1 mm3 (jedna dziesięciotysięczna mililitra). Rysunek 15-1 Struktura tablicy do liczenia krwinek (1) Rysunek 15-2 Struktura tablicy do liczenia krwinek (2) A. Widok z przodu; B. Przekrój podłużny; powiększona kwadratowa siatka, duży kwadrat pośrodku to komora zliczania 1. Tablica do liczenia komórek krwi; 2. Szkiełko nakrywkowe; 3. Podczas zliczania w komorze zliczającej zazwyczaj liczy się całkowitą liczbę bakterii w pięciu kwadratach, następnie znajduje się średnią wartość w każdym kwadracie i mnoży się przez 25 lub 16, aby otrzymać. Następnie przelicza się całkowitą liczbę bakterii w dużym kwadracie do całkowitej liczby bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego. Załóżmy, że całkowita liczba bakterii w pięciu środkowych kwadratach wynosi A, a współczynnik rozcieńczenia roztworu bakterii wynosi B. Jeśli jest to płytka licząca z 25 środkowymi kwadratami, to całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakterii {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (sztuk) W ten sam sposób, jeśli jest to płytka licząca z 16 kwadratami, całkowita liczba bakterii w 1 ml roztworu bakteryjnego {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (sztuki),,
