Różnica między mikroskopem fluorescencyjnym a mikroskopem normalnym
Niedawno próbowałem zrobić kilka zamrożonych kawałków myszy. Następnie użyję mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy wstrzyknięty przeze mnie wirus znajduje się w wybranym obszarze mózgu. Należy pokrótce poznać niektóre podstawowe zasady mikroskopii fluorescencyjnej i podzielę się nimi tutaj.
Mikroskopy fluorescencyjne wykorzystują światło ultrafioletowe jako źródło światła do oświetlania badanego obiektu, powodując, że obiekt emituje światło, a następnie obserwuje obiekt pod mikroskopem. Stosowany jest głównie do komórek immunofluorescencyjnych. Składa się głównie ze źródła światła, układu płytek filtrujących i układu optycznego. Fluorescencyjny obraz próbki obserwuje się poprzez powiększenie okularu i soczewki obiektywu. Przyjrzyjmy się różnicy między mikroskopem fluorescencyjnym a zwykłym mikroskopem optycznym.
1. Spójrz na metodę oświetlenia
Metodą oświetlenia mikroskopu fluorescencyjnego jest zazwyczaj epi-iluminacja, co oznacza, że źródło światła umieszcza się na badanej próbce przez soczewkę obiektywu.
2. Spójrz na rozdzielczość
Mikroskopy fluorescencyjne wykorzystują jako źródło światła światło ultrafioletowe, które ma krótszą długość fali, ale wyższą rozdzielczość niż zwykłe mikroskopy optyczne.
3. Różnice w filtrach
Mikroskopy fluorescencyjne wykorzystują dwa specjalne filtry, jeden umieszczony przed źródłem światła w celu odfiltrowania światła widzialnego, a drugi umieszczony pomiędzy soczewką obiektywu a okularem w celu odfiltrowania promieni ultrafioletowych, które mogą chronić ludzkie oczy.
Mikroskop fluorescencyjny jest również rodzajem mikroskopu optycznego. Głównym powodem jest to, że długość fali wzbudzana przez mikroskop fluorescencyjny jest krótka, co prowadzi do różnicy w strukturze i zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego i zwykłego mikroskopu. Większość mikroskopów fluorescencyjnych ma dobrą funkcję wychwytywania słabego światła. , więc jego zdolność obrazowania jest dobra również w przypadku wyjątkowo słabej fluorescencji. W połączeniu z ciągłym udoskonalaniem mikroskopów fluorescencyjnych w ostatnich latach, znacznie zmniejszono również hałas. Dlatego coraz częściej wykorzystuje się mikroskopy fluorescencyjne.
Znajomość dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej
Podstawowa zasada wzbudzenia dwufotonowego brzmi: w warunkach dużej gęstości fotonów cząsteczki fluorescencyjne mogą zaabsorbować jednocześnie dwa fotony o dużej długości fali, a po krótkim tzw. czasie życia w stanie wzbudzonym wyemitować foton o krótszej długości fali . ;Efekt jest taki sam, jak przy użyciu fotonu o długości fali o połowę mniejszej do wzbudzenia cząsteczek fluorescencyjnych. Wzbudzenie dwufotonowe wymaga dużej gęstości fotonów. Aby nie uszkodzić komórek, mikroskopy dwufotonowe wykorzystują wysokoenergetyczne lasery impulsowe z synchronizacją modów. Laser ten emituje światło lasera o wysokiej energii szczytowej i niskiej energii średniej, o szerokości impulsu wynoszącej zaledwie 100 femtosekund i częstotliwości od 80 do 100 MHz. W przypadku stosowania soczewki obiektywu o dużej aperturze numerycznej do skupiania fotonów lasera pulsacyjnego, gęstość fotonów w ognisku soczewki obiektywu jest najwyższa. Wzbudzenie dwufotonowe zachodzi tylko w ognisku soczewki obiektywu, dlatego mikroskop dwufotonowy nie wymaga konfokalnej dziurki, co poprawia skuteczność detekcji fluorescencji.
W ogólnym zjawisku fluorescencji, ze względu na niską gęstość fotonów światła wzbudzającego, cząsteczka fluorescencyjna może absorbować tylko jeden foton w tym samym czasie, a następnie emitować jeden foton fluorescencyjny poprzez przejście radiacyjne. Jest to fluorescencja pojedynczego fotonu. W procesie wzbudzenia fluorescencji z wykorzystaniem lasera jako źródła światła mogą wystąpić zjawiska fluorescencji dwufotonowej, a nawet wielofotonowej. W tym przypadku intensywność zastosowanego źródła światła wzbudzającego jest duża, a gęstość fotonów spełnia wymóg, aby cząsteczki fluorescencyjne pochłonęły dwa fotony jednocześnie. W procesie wykorzystywania zwykłych laserów jako źródeł światła wzbudzającego gęstość fotonów jest w dalszym ciągu niewystarczająca do wytworzenia absorpcji dwufotonowej. Zwykle stosuje się lasery impulsowe femtosekundowe, których moc chwilowa może sięgać poziomu megawatów. Dlatego długość fali fluorescencji dwufotonowej jest krótsza niż długość fali światła wzbudzającego, co jest równoważne efektowi wytwarzanemu przez wzbudzenie długości fali o połówkowym wzbudzeniu.
