Różnica między mikroskopem fluorescencyjnym a zwykłym mikroskopem optycznym
Różnica między mikroskopem fluorescencyjnym a zwykłym mikroskopem optycznym, mikroskopem fluorescencyjnym i zwykłym mikroskopem optycznym jest inna, obserwacja próbki nie polega na oświetleniu zwykłego źródła światła, ale na zastosowaniu określonej długości fali światła (zwykle ultrafioletowego, niebiesko-fioletowego) wzbudzenie preparatu pod mikroskopem w materiale fluorescencyjnym, tak aby emitował on światło fluorescencyjne, zatem rolą mikroskopu fluorescencyjnego w źródle światła nie jest bezpośrednie oświetlenie, ale rodzaj stymulacji fluorescencji wnętrza próbki źródłem mikroskopu fluorescencyjnego nie jest bezpośrednie oświetlenie, ale źródło energii stymulujące substancję fluorescencyjną wewnątrz próbki. Powodem, dla którego możemy obserwować preparat, nie jest oświetlenie źródła światła, ale zjawisko fluorescencji wywoływane przez substancję fluorescencyjną znajdującą się w preparacie po pochłonięciu wzbudzonej energii świetlnej. Można zauważyć, że mikroskop fluorescencyjny charakteryzuje się przede wszystkim tym, że jego źródło światła może dostarczać światło wzbudzające o dużej liczbie określonego zakresu długości fal, dzięki czemu substancje fluorescencyjne w badanej próbce mogą uzyskać niezbędne natężenie światła wzbudzającego. Jednocześnie mikroskop fluorescencyjny musi mieć odpowiedni system filtrów. Mikroskop fluorescencyjny jest podstawowym narzędziem do **histochemii fluorescencji. Składa się z ultrawysokociśnieniowego źródła światła, układu filtrów (w tym płytki filtra wzbudzającego i tłumiącego), układu optycznego i układu fotograficznego oraz innych głównych elementów. Polega na wykorzystaniu określonej długości fali światła w celu pobudzenia próbki do emisji fluorescencji.
1. sposób wzbudzenia fluorescencji: w zależności od zakresu długości fali światła dzieli się na metodę wzbudzenia UV (przy użyciu oświetlenia ultrafioletowego) i metodę wzbudzenia BV (przy użyciu światła niebiesko-fioletowego). Dwa rodzaje metod wzbudzenia UV są krótsze niż 400 nm w pobliżu światła ultrafioletowego pobudzenie. W tej metodzie nie ma widocznego światła wzbudzającego, zatem obserwowana fluorescencja wskazuje na nieodłączną fluorescencję barwnika i łatwo jest odróżnić specyficzną fluorescencję na próbce od samofluorescencji tkanki tła.
2. Metoda wzbudzenia BV: Metoda koncentruje się na długości fali 404 nm, 434 nm od ultrafioletu do światła niebieskiego w celu wzbudzenia. W tej metodzie do napromieniania próbki wykorzystuje się światło niebieskie, dlatego też filtr odcinający systemu obserwacji fluorescencji musi wykorzystywać filtr, który może całkowicie zablokować światło niebieskie i w pełni przejść przez pożądaną fluorescencję w kolorze zielonym i żółtym. Pigmenty fluorescencyjne do metody z przeciwciałami fluorescencyjnymi. Ponieważ długość fali maksymalnej absorpcji światła wzbudzającego i długość fali maksymalnej emisji fluorescencji są blisko siebie, filtry stosowane w metodzie wzbudzenia BV muszą być filtrami o ostrym odcięciu. W tej metodzie jako światło wzbudzające wykorzystuje się światło niebieskie, dzięki czemu skuteczność absorpcji fluorochromu jest większa i można uzyskać jaśniejszy obraz. Wadą jest to, że fluorescencja poniżej 500 nm jest niewidoczna, a powyżej 500 nm cały obraz wydaje się żółty. W metodzie fluorescencyjnej przeciwciał większość specyficzności ocenia się na podstawie koloru unikalnego dla fluorochromu, więc opisane powyżej wady metody wzbudzenia BV wydają się być niezwykle wpływowe przy omawianiu subtelnej specyficzności.
