Jak wybrać odpowiedni mikroskop fluorescencyjny
Mikroskop fluorescencyjny to standardowy sprzęt do obrazowania mikroskopowego w laboratoriach i zakładach patologii, który wykorzystuje charakterystykę fluorescencji do obserwacji i obrazowania. Jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach, takich jak biologia komórki, neurobiologia, botanika, mikrobiologia, patologia, genetyka itp. Obrazowanie fluorescencyjne ma zalety w postaci wysokiej czułości i specyficzności, dzięki czemu doskonale nadaje się do obserwacji rozmieszczenia określonych białek, organelli itp. w tkankach i komórkach, badając wspólną lokalizację i interakcje, śledząc dynamiczne procesy życiowe, takie jak zmiany stężenia jonów i tak dalej.
Dobór mikroskopów
Mikroskopy fluorescencyjne dzielą się głównie na trzy kategorie: pionowe mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do krojenia), odwrócone mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do żywych komórek, a także do krojenia) i stereoskopowe mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do większych okazów, takich jak rośliny, danio pręgowany (dorosłe/ embrionalny), Medaka, narządy myszy/szczura itp.).
Dobór bloków filtrów fluorescencyjnych
Przy wyborze bloków filtrów należy wziąć pod uwagę nie tylko długości fali wzbudzenia i emisji sond fluorescencyjnych, ale także rozważyć, czy występuje wzbudzenie niespecyficzne i czy w przypadku próbek oznaczonych wielobarwnie występują przesłuchy kolorów. W eksperymencie będziemy wybierać długość fali najbliższą szczytowi wzbudzenia w miarę możliwości dla wzbudzenia, a zakres odbioru powinien uwzględniać emisję szczytową. Szczyt wzbudzenia Alexa Fluor 488 wynosi 500 nm, a w mikroskopie fluorescencyjnym można wybrać filtr wzbudzenia 480/40. Powszechnie stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej bloki filtrów fluorescencyjnych można podzielić na dwa typy: długoprzepustowy (LP) i środkowoprzepustowy (BP), które również należy dobrać w zależności od potrzeb.
Mikroskop konfokalny
W tradycyjnych obserwacjach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, ze względu na nakładanie się substancji znakowanych fluorescencyjnie i spontanicznych struktur fluorescencyjnych, są one ściśle ze sobą powiązane. Jednak tradycyjne opadające obiektywy mikroskopii fluorescencyjnej nie tylko zbierają światło z płaszczyzny ogniskowej, ale także rozpraszają światło w górę i w dół płaszczyzny ogniskowej, co powoduje znaczne zmniejszenie rozdzielczości i kontrastu obrazu.
Obrazowanie konfokalne wykrywa jedynie światło odbite od płaszczyzny samoogniskowej, rozwiązując w ten sposób powyższy problem. Źródło światła tworzy małą i delikatną plamkę na płaszczyźnie ogniskowej przez dziurkę, a światło emitowane z płaszczyzny ogniskowej jest zbierane przez soczewkę obiektywu. Większość fluorescencji emitowanej z punktów powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu nie może zbiegać się do dziurki. Tylko fluorescencja znajdująca się w płaszczyźnie ogniskowej i niewielka część rozogniskowanej fluorescencji może przejść przez dziurkę, podczas gdy wiązka światła poza płaszczyzną ogniskową zbiega się przed lub za płytką otworkową i nie może przedostać się do detektora przez dziurkę. Wykryty obraz pochodzi z płaszczyzny ogniskowej, dzięki czemu ostateczna jakość obrazu jest znacznie poprawiona.
Ze względu na różne zalety i praktyczność skaningowej mikroskopii konfokalnej, jest ona obecnie niezastąpionym asystentem eksperymentalnym w precyzyjnych dziedzinach biologii komórki, botaniki i badań komórkowych. Jednocześnie w przyszłych ośrodkach naukowo-badawczych będzie to najbardziej podstawowe i podstawowe narzędzie badawcze.
