Techniki barwienia i obserwacja mikroskopowa mikroorganizmów
Proste barwienie bakterii
1 Cele
1.1 Poznanie podstawowych technik rozmazu i barwienia drobnoustrojów.
1.2 Opanować prostą metodę barwienia bakterii.
1.3 Zapoznanie się z charakterystyką morfologiczną bakterii oraz utrwalenie nauki stosowania zwierciadła olejowego i technik aseptycznych.
2 Zasada Rozmaz i barwienie bakterii to podstawowa technika w eksperymentach mikrobiologicznych. Komórki bakterii są małe i przezroczyste, niełatwo je rozpoznać pod zwykłym mikroskopem świetlnym i należy je wybarwić. Zastosowanie jednego barwnika do barwienia bakterii, dzięki czemu barwiony organizm i tło tworzą wyraźną różnicę kolorów, dzięki czemu można lepiej obserwować ich morfologię i strukturę. Metoda ta jest łatwa w wykonaniu i nadaje się do obserwacji ogólnego kształtu organizmu oraz rozmieszczenia bakterii. Barwniki alkaliczne są powszechnie stosowane do prostego barwienia, ponieważ w roztworach obojętnych, zasadowych lub słabo kwaśnych komórki bakteryjne są zwykle naładowane ujemnie, a gdy barwniki alkaliczne są zjonizowane, część barwiąca ich cząsteczek jest naładowana dodatnio, więc część barwiąca barwników alkalicznych może łatwo wiązać się z bakteriami, powodując ich zabarwienie. Zabarwione komórki bakteryjne ostro kontrastują z tłem i są łatwiejsze do rozpoznania pod mikroskopem. Powszechnie stosowane barwniki do prostego barwienia obejmują błękit merocyjaninowy, fiolet krystaliczny i zasadową czerwień złożoną. Kiedy bakteryjny rozkład cukru prowadzi do wytworzenia kwasu, w związku z czym pH podłoża spada, dodatni ładunek bakterii wzrasta, a następnie można je zastosować do barwienia na czerwono, kwaśną czerwienią lub czerwienią Kongo i innymi kwaśnymi barwnikami. Przed barwieniem bakterie muszą zostać utrwalone. Jego cel jest dwojaki: jeden to zabicie bakterii i sprawienie, aby bakterie przylegały do szkiełka; drugim jest zwiększenie jego powinowactwa do barwnika. Powszechnie stosuje się dwie metody: ogrzewanie i utrwalanie chemiczne. Podczas utrwalania staraj się zachować oryginalną morfologię komórek.
3 Materiały
3.1 Szczep Bacillus subtilis 12-18h kultura na skosie na agarze odżywczym, Staphylococcus aureus około 24-godzinna kultura na skosie na agarze odżywczym, Escherichia coli 24-godzinna kultura na skosie na agarze odżywczym, kultura na skosie z drożdżami piekarskimi.
3.2 Bejca Alkaliczna plama błękitu metylenowego Lue (lub fiolet krystaliczny szczawianu amonu), czerwona plama na bazie związku kwasu karbolowego.
3.3 Instrumenty lub inne akcesoria Mikroskop, lampa alkoholowa, szkiełko, pierścień do inokulacji, uchwyt na szkiełka, butelka dwuwarstwowa (wypełniona olejem cedrowym i ksylenem), bibuła mikroskopowa, sól fizjologiczna lub woda destylowana itp.
4 Procedura Rozmaz → suszenie → utrwalenie → barwienie → mycie → suszenie → badanie mikroskopowe.
5 kroków
5.1 rozmaz Pobrać dwa czyste i wolne od oleju szkiełka, każdy z małą kroplą soli fizjologicznej (lub wody destylowanej) na środku szkiełka, w warunkach aseptycznych, z pierścieniem do inokulacji, aby aseptycznie pracować, odpowiednio, z Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus i Escherichia coli skośne, zrywają odrobinę mchu z kropli wody, mieszają i pokrywają błoną. Jeśli rozmaz z zawiesiny bakteryjnej (lub płynnej kultury) można zastosować do zaszczepienia 2–3 pierścieni bezpośrednio na szkiełku. Należy pamiętać, że soli fizjologicznej (wody destylowanej) i zabrania bakterii nie powinno być za dużo i rozprowadzić równomiernie, niezbyt gęsto.
5.2 Suszenie Suszyć naturalnie w temperaturze pokojowej. Można go również suszyć, podgrzewając nieco nad lampą alkoholową, stroną powlekaną do góry. Nie zbliżaj się jednak zbyt blisko płomienia, gdyż zbyt wysoka temperatura zniszczy morfologię bakterii.
5.3 Utrwalanie Jeśli stosuje się suszenie na gorąco, utrwalanie i suszenie łączy się w jeden etap w taki sam sposób, jak suszenie. Rozmazać, osuszyć i utrwalić termicznie.
5.4 Barwienie Połóż szkiełko płasko na półce szkiełek, dodaj 1 do 2 kropli roztworu barwiącego na rozmaz (właściwy jest roztwór barwiący, który jedynie zakrywa warstwę rozmazu). Zabarwiaj rozmaz podstawowym błękitem Mellanox Blue Lü przez 1 ~ 2 minuty i czerwienią węglanową (lub fioletem krystalicznym szczawianu amonu) przez około 1 minutę.
5.5 Płukanie Wylać roztwór barwiący i delikatnie spłukać wodą kranową z jednego końca szkiełka, aż woda spływająca z rozmazu stanie się bezbarwna. Podczas płukania nie dopuścić do bezpośredniego spływu wody w celu umycia pomalowanej powierzchni. Przepływ wody nie powinien być zbyt szybki ani zbyt duży, aby uniknąć usunięcia warstwy mazistej.
5.6 Suszenie Strząśnij kropelki wody ze szkiełka, aby wyschły w sposób naturalny. Do wchłonięcia można użyć suszarki lub papieru chłonnego (uważaj, aby nie wytrzeć ciała bakterii). 5.7 Badanie mikroskopowe Rozmaz suszy się i bada pod mikroskopem. Rozmaz musi całkowicie wyschnąć, zanim będzie można go obserwować pod mikroskopem olejowym.
6 Wyniki Narysuj morfologię E. coli i Micrococcus garciniae po pojedynczym barwieniu.
Plama Grama
1 Cel
1.1 Zrozumienie zasady barwienia metodą Grama i jej znaczenia w klasyfikacji i identyfikacji bakterii.
1.2 Poznanie i opanowanie techniki barwienia metodą Grama oraz utrwalenie wiedzy na temat stosowania soczewki olejowej mikroskopu świetlnego.
