Zależność całkowitego powiększenia od rozdzielczości mikrobiologicznych zwierciadeł olejowych
Soczewki obiektywowe mikroskopów używane w badaniach mikrobiologicznych to zazwyczaj soczewki olejowe o małym powiększeniu (10 x), soczewki obiektywowe o dużym powiększeniu (40 x) i soczewki olejowe (10 0 x). Znajduje się tam również słowo „OI” (zanurzenie w oleju) wskazujące, że jest to ten o największym powiększeniu spośród całej trójki. W zależności od zastosowania okularów o różnych powiększeniach badany obiekt można powiększyć 1000-1600 razy. Podczas użytkowania różnica między soczewką olejkową a innymi soczewkami obiektywowymi polega na tym, że pomiędzy zamkiem a soczewką obiektywową nie znajduje się warstwa powietrza, ale warstwa oleju, co nazywa się systemem immersji olejkowej. W tego typu olejach często wykorzystuje się olej cedrowy, ponieważ jego współczynnik załamania światła wynosi n=1.52, czyli tyle samo co szkło. Kiedy światło przechodzi przez szkiełko, może bezpośrednio przedostać się do obiektywu poprzez olej cedrowy, bez załamania światła. Jeśli ośrodkiem pomiędzy szkiełkiem a soczewką obiektywu jest powietrze, nazywa się to układem suchym. Światło przechodząc przez szkiełko ulega rozproszeniu na skutek załamania, a ilość światła wpadającego do obiektywu ulega wyraźnemu zmniejszeniu, co powoduje zmniejszenie oświetlenia pola widzenia. Zastosowanie zwierciadeł olejowych może nie tylko zwiększyć oświetlenie, ale przede wszystkim zwiększyć aperturę numeryczną, ponieważ skuteczność powiększenia mikroskopu zależy od jego apertury numerycznej. Tak zwana apertura numeryczna odnosi się do iloczynu połowy sinusa maksymalnego kąta, pod jakim światło jest rzucane na soczewkę obiektywu (zwanego kątem apertury) pomnożonego przez współczynnik załamania światła ośrodka znajdującego się pomiędzy szkiełkiem a soczewką obiektywu . Można to wyrazić następującym wzorem: NA=nx sin , gdzie NA=apertura numeryczna; N=współczynnik załamania światła ośrodka; A{{10}}połowa maksymalnego kąta padania, tj. połowa kąta rozwarcia. Zatem im większy kąt, pod jakim światło rzucane jest na soczewkę obiektywu, tym większa jest skuteczność mikroskopu, a o wielkości tego kąta decyduje średnica i ogniskowa soczewki obiektywu. Tymczasem teoretyczna granica a wynosi 90..sin90.＝1. Zatem w przypadku stosowania powietrza jako ośrodka (n=1) apertura numeryczna nie może przekraczać 1. Na przykład, gdy jako medium stosuje się smołę, n wzrasta, a także wzrasta jego apertura numeryczna. Jeśli kąt padania światła wynosi 120o, a połowa jego sinusa to sin6{{60}o=0.87, to: przy użyciu powietrza jako ośrodka: NA =1 x 0,87=0,87, przy zastosowaniu wody jako medium: NA=1,33 x 0,87=1,15, przy zastosowaniu smoły jako medium: NA =1.52 x 0.87=1.32. Rozdzielczość mikroskopu odnosi się do jego zdolności do rozróżnienia minimalnej odległości między dwoma punktami. Jest ona proporcjonalna do apertury numerycznej obiektywu i odwrotnie proporcjonalna do długości fali. Dlatego im większa apertura numeryczna obiektywu, tym krótsza długość fali świetlnej i większa rozdzielczość mikroskopu. Można również wyraźnie rozróżnić drobniejsze struktury badanego obiektu. Zatem wysoka rozdzielczość oznacza małą rozróżnialną odległość, a te dwa czynniki są odwrotnie proporcjonalne. Niektórzy ludzie często określają rozdzielczość jako liczbę mikrometrów lub nanometrów, co w rzeczywistości myli rozdzielczość z minimalną odległością rozdzielczości. Rozdzielczość mikroskopu jest reprezentowana przez minimalną odległość, którą można rozdzielić. Minimalna odległość między dwoma punktami, jaką można rozróżnić, to λ/2NA. We wzorze λ=długość fali świetlnej, a średnia długość fali świetlnej, którą można dostrzec gołym okiem, wynosi 0,55 μm. Jeśli używany jest obiektyw o dużym powiększeniu i aperturze numerycznej 0,65, odległość między dwoma punktami może zostać rozróżniona na poziomie 0,42 μm. Nie można jednak rozróżnić odległości między dwoma punktami poniżej 0,42 μm, nawet przy większym okularze powiększenia nadal nie można rozróżnić całkowitego powiększenia mikroskopu. Tylko stosując większe obiektywy z większymi aperturami numerycznymi można zwiększyć ich rozdzielczość. Na przykład, stosując zwierciadło olejowe o aperturze numerycznej 1,25, minimalna odległość między dwoma punktami, jaką można rozróżnić, wynosi 0,55/(2 x 1,25)=0,22 μm. Widzimy więc, że jeśli zastosujemy obiektyw o dużej mocy i 40-krotnym powiększeniu (NA=0.65) i okular o 24-krotnym powiększeniu, mimo że całkowite powiększenie wynosi 960 razy, minimalne odległość rozdzielczości wynosi tylko 0,42 μm. Jeśli zastosuje się zwierciadło olejowe o powiększeniu 90 razy (NA=1.25) i okular o powiększeniu 9 razy, mimo że całkowite powiększenie wynosi 810 razy, można wyróżnić odległość 0,22 μm.
