Korzyści wynikające z zastosowania laserowych mikroskopów wielofotonowych
Laserowy skaningowy mikroskop wielofotonowy stanowi znaczące udoskonalenie mikroskopii optycznej, objawiające się głównie możliwością obserwacji głębokich struktur żywych komórek, komórek utrwalonych i tkanek oraz uzyskiwania wyraźnych i ostrych wielo-warstwowych-struktur płaszczyzny Z, czyli przekrojów optycznych, które można wykorzystać do konstruowania trójwymiarowych-stałych struktur preparatów. Mikroskop konfokalny wykorzystuje laserowe źródło światła, które jest rozszerzane w celu wypełnienia całej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu, a następnie skupiane w bardzo małych punktach na płaszczyźnie ogniskowej preparatu poprzez układ soczewek soczewki obiektywu. Według apertury numerycznej obiektywu średnica najjaśniejszego punktu oświetleniowego wynosi około 0,25-0,8 μm, a głębokość około 0,5-1,5 μm. Rozmiar punktu konfokalnego zależy od konstrukcji mikroskopu, długości fali lasera, charakterystyki obiektywu, ustawień stanu jednostki skanującej i właściwości próbki. Zasięg oświetlenia i głębokość pola mikroskopu są duże, podczas gdy oświetlenie mikroskopu konfokalnego skupia się na bezpiecznym punkcie ogniskowym w płaszczyźnie ogniskowej. Najbardziej podstawową zaletą mikroskopii konfokalnej jest to, że umożliwia ona dokładne cięcie optyczne grubych próbek fluorescencyjnych (do 50 μm lub więcej) o grubości od około 0,5 do 1,5 μm. Serię optycznych obrazów warstw można uzyskać, przesuwając preparat w górę i w dół za pomocą silnika krokowego osi Z- mikroskopu. Zbieranie informacji o obrazie jest kontrolowane w bezpiecznej płaszczyźnie i nie będzie zakłócane przez sygnały emitowane z innych miejsc próbki. Po usunięciu wpływu fluorescencji tła i zwiększeniu stosunku sygnału do szumu kontrast i rozdzielczość obrazów konfokalnych ulegają znacznej poprawie w porównaniu z tradycyjnymi obrazami fluorescencyjnymi przy oświetleniu polowym. W wielu okazach skomplikowane elementy konstrukcyjne przeplatają się, tworząc złożone układy, ale gdy uda się zgromadzić wystarczającą liczbę przekrojów optycznych, możemy użyć oprogramowania do zrekonstruowania ich w trzech wymiarach. Ta metoda eksperymentalna jest szeroko stosowana w badaniach biologicznych w celu wyjaśnienia złożonych powiązań strukturalnych i funkcjonalnych między komórkami lub tkankami.
