Jak obserwuje się morfologię komórek drobnoustrojów pod mikroskopem?
Mikroskopy zostały wynalezione, aby widzieć uśmiechnięte przedmioty, których nie można zobaczyć gołym okiem. Mikroorganizmy są bardzo małe, dlatego należy je powiększać i obserwować pod mikroskopem. Ponadto istnieje wiele rodzajów mikroorganizmów, dlatego w zasadzie większość mikroskopów optycznych może obserwować mikroorganizmy. Kolejnym pytaniem jest, jakiego rodzaju mikroskopu należy używać do obserwacji i analizy jakiego rodzaju mikroorganizmów. Typowe mikroskopy, których można używać do obserwacji morfologii drobnoustrojów, obejmują mikroskopy biologiczne, mikroskopy z kontrastem fazowym, mikroskopy odwrócone, mikroskopy fluorescencyjne, mikroskopy konfokalne itp.
Poniżej opisano różne mikroskopy używane do obserwacji mikroorganizmów:
1. Zwykły mikroskop optyczny wykorzystuje światło naturalne lub światło jako źródło światła, a jego długość fali wynosi około 0,4 μm. Rozdzielczość mikroskopu wynosi połowę długości fali, czyli 0,2 μm, a najmniejszy obraz widoczny gołym okiem to 0,2 mm. Dlatego użycie lustra olejowego (immersyjnego) do powiększenia 1000 razy może powiększyć cząstki o wielkości 0,2 μm do rozmiarów 0,2 mm widocznych gołym okiem. Do obserwacji bakterii, promieniowców i grzybów można używać zwykłych mikroskopów optycznych.
2. Mikroskopia ciemnego pola jest powszechnie stosowana do obserwacji morfologii i ruchu niezabarwionych drobnoustrojów. Po zainstalowaniu kondensora ciemnego pola w zwykłym mikroskopie światło nie może przenikać bezpośrednio ze środka, a pole widzenia jest ciemne. Kiedy próbka otrzymuje ukośne światło z krawędzi kondensatora, może zostać rozproszone, dzięki czemu na ciemnym tle pola można obserwować jasne mikroorganizmy, takie jak bakterie lub krętki.
3. Mikroskop z kontrastem fazowym Mikroskop z kontrastem fazowym wykorzystuje efekt świetlny płytki różnicy faz do zmiany fazy światła i amplitudy światła bezpośredniego oraz do przekształcenia różnicy fazy światła w różnicę natężenia światła. Pod mikroskopem z kontrastem fazowym, gdy światło przechodzi przez niezabarwioną próbkę, różnica w fazie światła jest spowodowana niespójnością gęstości różnych części próbki i można zaobserwować morfologię, strukturę wewnętrzną i sposób poruszania się mikroorganizmów.
4. Mikroskop fluorescencyjny Mikroskop fluorescencyjny jest w zasadzie tym samym, co zwykły mikroskop optyczny, główną różnicą jest źródło światła, filtr i kondensator. Obecnie większość z nich wykorzystuje urządzenia epi-light, a jako źródła światła powszechnie stosuje się wysokoprężne lampy rtęciowe, które mogą emitować światło ultrafioletowe lub niebiesko-fioletowe. Istnieją dwa rodzaje filtrów: filtr wzbudzenia i filtr absorpcyjny. Oprócz ogólnych kondensatorów jasnego pola, w mikroskopach fluorescencyjnych można również stosować kondensatory ciemnego pola, wykorzystujące światło niebieskie w celu zwiększenia kontrastu między fluorescencją a tłem. Metodę tę można zastosować do wykrywania lub identyfikacji bakterii barwionych pigmentami fluorescencyjnymi lub połączonych z przeciwciałami fluorescencyjnymi.
5. Mikroskopy elektronowe wykorzystują przepływ elektronów jako źródło światła, a długość fali jest dziesiątki tysięcy razy różna od światła widzialnego, co znacznie poprawia rozdzielczość. Wykorzystuje również cewkę magnetyczną jako system wzmocnienia optycznego, a powiększenie może osiągnąć dziesiątki tysięcy lub setki tysięcy razy. Jest często używany do obserwacji cząstek wirusów i ultrastruktury bakterii.
Obserwacja niezabarwionych próbek drobnoustrojów:
Niezabarwione próbki można na ogół wykorzystać do obserwacji morfologii, mocy i ruchu bakterii. Bakterie są bezbarwne i przezroczyste, gdy nie są zabarwione, a pod mikroskopem można je obserwować głównie na podstawie różnicy między współczynnikiem załamania światła bakterii a otaczającym środowiskiem. Bakterie posiadające wici poruszają się energicznie, natomiast bakterie bez wici wykazują nieregularne ruchy Browna. Żywe bakterie, takie jak Treponema pallidum, Leptospira i Campylobacter, mają charakterystyczne kształty i wzorce ruchu, które mają znaczenie diagnostyczne. Powszechnie stosowanymi metodami są metoda spadku ciśnienia, metoda wiszącej kropli i metoda kapilarna.
1. Nałóż wazelinę wokół wklęsłego otworu czystego wklęsłego szkła metodą zawieszania kropli, użyj ezy do inokulacji, aby pobrać pierścień zawiesiny bakteryjnej i umieść go na środku szkiełka nakrywkowego, następnie zrównaj wklęsły otwór wklęsłego szkła z kroplę na środku szkiełko nakrywkowe i przykryj, następnie szybko odwróć, lekko dociśnij szkiełko tak, aby dobrze przylegało do wazeliny na krawędzi wklęsłego otworu i obserwuj pod mikroskopem o dużym powiększeniu (lub ciemne pole).
2. Wziąć krążek zawiesiny bakteryjnej z ezą do inokulacji i umieścić go na środku czystego szkiełka metodą spadku ciśnienia, a następnie delikatnie przykryć zawiesinę bakteryjną szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków i przelania się zawiesiny bakteryjnej . Po kilkusekundowym bezruchu obserwuj pod mikroskopem o dużej mocy w jasnym (lub ciemnym) polu.
3. Metodę kapilarną stosuje się głównie do badania kinetyki bakterii beztlenowych. Zwykle wybieraj długość 60~70mm. Po przepuszczeniu zawiesiny bakterii beztlenowych przez kapilarę o średnicy 0,5-1,0 mm, uszczelnij płomieniem oba końce kapilary. Kapilarę przymocowano do szkiełka za pomocą plastikowego papieru i obserwowano pod soczewką o dużej mocy w ciemnym polu.
Obserwacja wybarwionych próbek drobnoustrojów pod mikroskopem:
Po wybarwieniu próbki bakteryjnej, ze względu na ostry kontrast koloru pomiędzy bakteriami a otaczającym środowiskiem, cechy morfologiczne bakterii (takie jak wielkość, kształt, rozmieszczenie itp.) oraz niektóre specjalne struktury (takie jak jak kapsułki, wici, zarodniki itp.) można wyraźnie zaobserwować pod zwykłym mikroskopem optycznym, a bakterie można klasyfikować i identyfikować na podstawie reaktywności barwienia.
(1) Ogólna procedura barwienia bakteryjnego Ogólna procedura barwienia bakteryjnego jest następująca: rozmaz (suszenie) – utrwalanie – barwienie.
1. Rozmaz Przygotowanie krwi, wydzielin, wydalin, płynu do nakłucia i płynnej hodowli oraz bezpośrednie rozmazy cienkowarstwowe na szkiełkach szklanych; sekcji zwłok lub zakażonych tkanek zwierzęcych, należy posmarować zmianę wacikiem w celu pobrania próbki. W celu przygotowania kolonii bakteryjnych lub trawników na podłożu stałym, najpierw użyj ezy do inokulacji, aby pobrać pierścień normalnej soli fizjologicznej i umieść go na środku szkiełka, następnie użyj sterylnej ezy do inokulacji, aby pobrać niewielką ilość kultury i zmielić rozprowadzić równomiernie w zwykłej soli fizjologicznej, rozprowadzić na pokrytej powierzchnią o powierzchni 1 cm2 i pozostawić do naturalnego wyschnięcia w temperaturze pokojowej lub powoli wyschnąć z dużej odległości.
2. Celem utrwalenia jest zabicie bakterii, koagulacja białka i struktury bakteryjnej oraz ułatwienie barwienia; sprzyjają przyleganiu bakterii do szkiełka, aby uniknąć wypłukania ich przez wodę podczas mycia; zmieniają przepuszczalność bakterii dla barwników, co korzystnie wpływa na barwienie struktur wewnątrzkomórkowych bakterii. Zwykle utrwala się go przez ogrzewanie płomieniem, a wysuszoną mazię szybko przepuszcza się przez płomień 3 razy. Lepiej nie palić skóry na grzbiecie dłoni, gdy dotyka ona szkiełka.
3. Barwienie Zgodnie z różnymi celami kontroli, wybierz różne metody barwienia do barwienia. Podczas barwienia dodawaj kroplami roztwór barwnika, aby zwiększyć krycie.
4. Zaprawa Zaprawą nazywa się każdą substancję, która może zwiększyć powinowactwo barwnika do barwionego przedmiotu, utrwalić barwnik na barwionym przedmiocie i spowodować zmianę przepuszczalności błony komórkowej. Powszechnie stosowane są ałun, kwas garbnikowy, sole metali i jod itp., a w celu wspomagania barwienia stosuje się również ogrzewanie. Zaprawy można stosować pomiędzy barwieniem pierwotnym a barwieniem kontrastowym, można je również stosować po utrwaleniu lub zawarte w utrwalaczu i barwieniu.
5. Odbarwianie Każdy środek chemiczny, który może usunąć kolor barwionego przedmiotu, nazywany jest odbarwiaczem. Jako odbarwiacze powszechnie stosuje się etanol, aceton itp. Środek odbarwiający może wykryć stopień stabilności kombinacji bakterii i barwników, które można zastosować do barwienia różnicowego.
6. Barwienie kontrastowe Bakterie lub ich struktury, które zostały odbarwione, często barwi się kontrastowo roztworem barwnika kontrastowego, aby ułatwić obserwację. Kolor roztworu barwiącego kontrastującego różni się od barwy podstawowego roztworu barwiącego, tworząc ostry kontrast. Barwienie kontrastowe nie powinno być zbyt mocne, aby nie zakryć koloru pierwotnego zabarwienia.
