Laserowa mikroskopia konfokalna - funkcje i zastosowania
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna (LSCM) to rodzaj mikroskopu zaprojektowanego w oparciu o technologię ogniskowania sprzężonego, to znaczy laserowe źródło światła, mierzona próbka i detektor znajdują się względem siebie w pozycjach sprzężonych.
Fundamentalny
W mikroskopie ogólnym płaszczyzna obserwacji obrazu jest izolowana od sąsiedniej płaszczyzny osiowej poprzez zbieżność płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu z detektorem, natomiast w mikroskopie konfokalnym do oświetlenia próbki wykorzystuje się plamkę świetlną o ograniczonej dyfrakcji, a A Otwór otworkowy jest stosowany w ścieżce zebranego światła w sprzężonym ognisku plamki świetlnej w celu filtrowania światła rozproszonego w celu uzyskania efektu izolacji, a tym samym poprawy rozdzielczości.
Funkcje obrazowania
Obrazowanie skaningowe sekcji optycznej
Inną cechą skaningowej mikroskopii konfokalnej jest to, że jest to technologia obrazowania skaningowego. Tradycyjna technologia oświetlenia szerokokątnego oświetla całą próbkę, więc obraz można uchwycić bezpośrednio gołym okiem lub detektorem, ale LSCM wykorzystuje wiązkę lub wiele skupionych wiązek przechodzi przez próbkę do skanowania i tworzenia obrazu. Powstały obraz nazywany jest sekcją optyczną. Poniżej przedstawiono różnicę pomiędzy tradycyjną metodą oświetlenia szerokokątnego a metodą oświetlenia konfokalnego ze skanowaniem laserowym.
Dlatego rzeczywista metoda działania współczesnego mikroskopu konfokalnego jest pokazana na poniższym rysunku. Światło wzbudzenia emitowane przez laser przechodzi przez zwierciadło dichroiczne i jest skanowane w kierunku x i y próbki przez parę galwanometrów. Wzbudzenie (lub odbicie) próbki Światło wchodzi do detektora PMT przez dziurkę i jest rejestrowane, a zarejestrowany zeskanowany obraz jest rekonstruowany przez komputer w celu zrekonstruowania rzeczywistego obrazu próbki.
Generuj obrazy typu „z-stack” w różnych płaszczyznach ogniskowych
Tylko światło odbite od sprzężonej warstwy próbki może przejść przez mały otwór w ścieżce światła zbierającego, a pozostałe, nieistotne odbicia warstwy próbki są blokowane przez mały otwór. Może to skutkować znaczną poprawą rozdzielczości. Bezpośrednie porównanie wielowymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii konfokalnej tej samej grubej próbki. Kiedy wykonuje się serię zdjęć w różnych płaszczyznach ogniskowych, można wygenerować obrazy powszechnie określane jako „stosy Z”, które ilustrują wzrost rozdzielczości i kontrastu zapewniany przez mikroskopię konfokalną oraz podstawowe przyczyny tych wzmocnień. Można zauważyć, że badanie obrazu na górze stosu z płaszczyzną obrazowania nad tkanką ujawnia dużą ilość rozproszonego światła na obrazie fluorescencyjnym, podczas gdy obraz z mikroskopu konfokalnego wydaje się czarny. To zmniejszenie osiowego PSF bezpośrednio skutkuje różnicą rozdzielczości obserwowaną na interfejsie optycznym pośrodku stosu Z.
Rozdzielczość jest znacznie lepsza w porównaniu do oświetlenia szerokokątnego
W mikroskopii fluorescencyjnej natężenie światła emitowanego z pojedynczego punktu opisuje się funkcją rozproszenia punktu (PSF), a jej wzorem jest dysk Airy'ego. Rozdzielczość układu fluorescencyjnego można opisać promieniem krążka Airy'ego, który można opisać wzorem. Apertura numeryczna soczewki obiektywu i długość fali światła wzbudzającego określają
