Technologia obrazowania metodą mikroskopii wielofotonowej: mikroskopia-rozdzielcza drugiej-generacji harmonicznej z polaryzacją i jej przetwarzanie obrazu
W nieliniowych mikroskopach optycznych do obserwacji endogennych struktur włóknistych powszechnie stosuje się obrazowanie drugiej harmonicznej (SHG), a intensywność SHG w dużej mierze zależy od względnego kąta między kierunkiem polaryzacji padającej wiązki a osią orientacji cząsteczki docelowej. Dlatego obrazowanie SHG oparte na polaryzacji (P-SHG) może uzyskać informacje strukturalne o cząsteczkach docelowych poprzez analizę zależności funkcjonalnej między intensywnością sygnału SHG a stanem polaryzacji padającej wiązki. Obecnie jest używany jako ważne narzędzie do analiz medycznych i biologicznych.
Proste obrazy SHG można uzyskać za pomocą tradycyjnej mikroskopii fluorescencyjnej ze wzbudzeniem dwu-fotonów (TPM). Większość systemów TPM nadal wykorzystuje metodę skanowania pojedynczą wiązką opartą na ruchomym zwierciadle, którego rozdzielczość czasowa zależy od fizycznej prędkości ruchu zwierciadła. Aby uzyskać szybsze obrazowanie, system TPM może również zastosować metodę skanowania wielowiązkowego (rysunek 1A), z których jedna polega na wykorzystaniu jednostki skanującej z obrotowym dyskiem. To urządzenie składa się ze współosiowego gramofonu z mikrosoczewkami i gramofonu z otworkami, przy czym mikrosoczewki i otwory na każdym gramofonie odpowiadają sobie--.
Kiedy laser przechodzi przez stół obrotowy z mikrosoczewkami, czoło fali pokrywa wiele mikrosoczewek. Różne mikrosoczewki skupiają różne części czoła fali w różnych pozycjach i przechodzą przez odpowiednie otwory, tworząc wiele mikrowiązek. Te mikrowiązki uderzające w próbkę mogą jednocześnie wzbudzić wiele sygnałów. Sygnały te wracają przez system mikroskopu i ponownie przechodzą przez otworek, a na koniec są odbijane przez lustro dichroiczne pomiędzy dwoma stołami obrotowymi do urządzenia detekcyjnego. Jednak powszechnie używany-laser tytanowo-szafirowy z blokadą jako źródło światła ma niewystarczającą energię, co ogranicza liczbę wiązek wzbudzających i skutkuje małym efektywnym polem widzenia (FOV) dla TPM (TPM-SD) przy użyciu obrotowej jednostki skanującej.
Ai Goto i in. którego celem było uzyskanie-szybkiego obrazowania P-SHG z dużym polem widzenia (FOV) przy użyciu systemu TPM-SD. Dlatego do systemu TPM-SD wprowadzono źródło lasera na bazie Yb o wyższej mocy szczytowej.
To jest schematyczny diagram opracowanego przez nich systemu TPM-SD. Źródłem światła systemu jest laser na bazie Yb, który generuje femtosekundowe impulsy o środkowej długości fali 1042 nm, średniej mocy 4 W, szerokości impulsu 300 fs i częstotliwości powtarzania 10 MHz. System najpierw reguluje moc lasera za pomocą płytki półfalowej i polaryzatora laserowego Glan, a następnie rozszerza wiązkę za pomocą ekspandera wiązki. Rozszerzona wiązka jest wprowadzana do jednostki skanującej stołu obrotowego, a wiele mikrowiązek wychodzących z jednostki skanującej jest skupianych na wielu punktach próbki przez zanurzoną w wodzie soczewkę obiektywu. W celu regulacji stanu polaryzacji wiązki światła na obiektywie, na drodze optycznej wiązki wzbudzającej umieszcza się płytkę półfalową i ćwierćfalową.
