Zasady laserowej mikroskopii konfokalnej (LSCM)
Laserowy mikroskop konfokalny wykorzystuje dziurkę oświetlającą umieszczoną za źródłem światła i dziurkę detekcyjną umieszczoną przed detektorem, aby uzyskać oświetlenie punktowe i detekcję punktu. Światło ze źródła światła skupia się w punkcie w płaszczyźnie ogniskowej próbki przez światło emitowane przez otworek oświetlający, a fluorescencja emitowana z tego punktu jest obrazowana w otworku detekcyjnym, a wszelkie światło emitowane poza tym punktem jest blokowane przez dziurka detekcyjna. Otwór oświetlający i otwór detekcyjny są sprzężone dla oświetlonego lub wykrytego punktu, tak że wykryty punkt jest punktem konfokalnym, a płaszczyzna, w której znajduje się wykryty punkt, jest płaszczyzną konfokalną. Komputer wyświetla wykryty punkt na ekranie komputera w postaci punktu obrazowego. Aby uzyskać pełny obraz, system skanujący w ścieżce optycznej skanuje płaszczyznę ogniskową próbki, tworząc w ten sposób pełny obraz konfokalny. Dopóki stolik nośny porusza się w górę i w dół wzdłuż osi Z, nowy poziom próbki przesuwa się do płaszczyzny konfokalnej, a nowy poziom próbki jest obrazowany na monitorze, w miarę jak oś Z kontynuuje przesuwanie się ruchu, uzyskuje się kolejne prześwietlone obrazy różnych poziomów próbki.
Tradycyjny mikroskop optyczny wykorzystuje polowe źródło światła, a obraz każdego punktu próbki będzie zakłócany przez dyfrakcję lub rozpraszanie światła z sąsiednich punktów; laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wykorzystuje wiązkę lasera przechodzącą przez oświetloną dziurkę, aby utworzyć punktowe źródło światła na próbce skanowanej w każdym punkcie wewnętrznej płaszczyzny ogniskowej, próbce w napromieniowanym punkcie, obrazowaniu dziurki detekcyjnej, poprzez wykrycie dziurki za punktem, w którym znajduje się rurka powielająca światło (PMT) lub urządzenie z zimnym prądem elektrycznym (ccCCD). Obraz fluorescencyjny odbierany punkt po punkcie lub linia po linii szybko tworzy się na ekranie monitora komputera. Otworki oświetlenia i otworki detekcji względem płaszczyzny ogniskowej obiektywu są sprzężone, punkt na płaszczyźnie ogniskowej jest jednocześnie skupiony na otworku oświetlenia i otworku emisji, punkt poza płaszczyzną ogniskowej nie będzie wykrywany otworkowa przy obrazowaniu, dzięki czemu uzyskany obraz konfokalny jest przekrojem optycznym próbki, przezwyciężając mankamenty rozmytego obrazu w zwykłym mikroskopie.
Z podstawowej zasady laserowy mikroskop konfokalny jest nowoczesnym mikroskopem optycznym, jest to zwykły mikroskop świetlny z technologią wprowadzającą następujące ulepszenia.
1. Użyj lasera jako źródła światła, ponieważ monochromatyczność lasera jest bardzo dobra, długość fali wiązki źródła światła jest taka sama, co zasadniczo eliminuje aberrację chromatyczną.
2. Zastosowanie technologii konfokalnej w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu umieszczonej pośrodku z małym otworem w przesłonie, płaszczyzna ogniskowa na zewnątrz blokuje światło rozproszone, eliminując aberrację sferyczną; i dodatkowo wyeliminować aberrację chromatyczną.
3. Laserowy mikroskop konfokalny wykorzystujący technologię skanowania punktowego do rozłożenia próbki na przestrzeń dwuwymiarową lub trójwymiarową na niezliczoną ilość punktów za pomocą bardzo małej wiązki laserowej (punktowego źródła światła) obrazowania punkt po punkcie, linia po linii, a następnie poprzez skanowanie mikrokomputerowa kombinacja całej płaszczyzny lub obrazu trójwymiarowego. Tradycyjny mikroskop świetlny jest polowym źródłem światła w ramach jednorazowego obrazowania, próbki w każdym punkcie obrazu będą przylegać do punktu ugiętego światła i rozproszonej interferencji światła. Jasności i precyzji tych dwóch obrazów nie można porównywać.
4. Akwizycja i przetwarzanie sygnałów optycznych za pomocą komputera oraz wzmacnianie sygnałów za pomocą fotopowielacza
W laserowym mikroskopie konfokalnym komputer zastępuje ludzkie oko lub kamerę do obserwacji i nagrywania wideo, a uzyskane obrazy są digitalizowane i mogą być przetwarzane w komputerze w celu ponownej poprawy przejrzystości obrazów. Co więcej, zastosowanie fotopowielaczy może wzmocnić bardzo słabe sygnały, znacznie poprawiając czułość. W wyniku łącznego zastosowania powyższych technologii można stwierdzić, że LSCM jest najbardziej zaawansowanym mikroskopem na świecie. Można powiedzieć, że LSCM to połączenie technologii produkcji mikroskopów, technologii fotoelektrycznej, technologii komputerowej**, jest nieuniknionym produktem rozwoju nowoczesnej technologii.
