Cel, cechy i zastosowanie mikroskopu fluorescencyjnego
Zasada i cechy strukturalne mikroskopu fluorescencyjnego: mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje punktowe źródło światła o wysokiej wydajności świetlnej do emitowania określonej długości fali światła (takiej jak światło ultrafioletowe 3650 cali lub fioletowo-niebieskie światło 4200 cali) przez system filtrów jako wzbudzenie światło w celu stymulacji fluorescencji w próbce. Po tym, jak substancja wyemituje fluorescencję o różnych kolorach, obserwuje się ją przez powiększenie obiektywu i okularu. W ten sposób, na silnie kontrastowym tle, nawet jeśli fluorescencja jest bardzo słaba, jest łatwa do zidentyfikowania i ma wysoką czułość. Stosowany jest głównie do badań struktury i funkcji komórek oraz składu chemicznego. Podstawowa struktura mikroskopu fluorescencyjnego składa się ze zwykłego mikroskopu optycznego oraz niektórych akcesoriów (takich jak źródło światła fluorescencyjnego, filtr wzbudzający, rozdzielacz wiązki dwukolorowej i filtr blokujący itp.). Fluorescencyjne źródło światła — zwykle stosuje się ultrawysokociśnieniową lampę rtęciową (50-200 W), która może emitować światło o różnych długościach fal, ale każda substancja fluorescencyjna ma długość fali wzbudzenia, która wytwarza najsilniejszą fluorescencję, dlatego filtr wzbudzenia ( Ogólnie rzecz biorąc, istnieją ultrafioletowe, fioletowe, niebieskie i zielone filtry wzbudzające), które przepuszczają tylko światło wzbudzające o określonej długości fali i napromieniowują preparat, pochłaniając inne światło. Po napromieniowaniu światłem wzbudzenia każda substancja emituje widzialną fluorescencję o długości fali dłuższej niż długość fali napromieniowania w bardzo krótkim czasie. Fluorescencja jest specyficzna i generalnie słabsza niż światło wzbudzające. Aby obserwować specyficzną fluorescencję, za soczewką obiektywu wymagany jest filtr blokujący (lub tłumiący).
Ma dwie funkcje: jedna polega na pochłanianiu i blokowaniu przedostawania się światła wzbudzającego do okularu, aby nie zakłócać fluorescencji i nie uszkodzić oczu; drugim jest wybranie i przepuszczanie określonej fluorescencji, pokazując określony kolor fluorescencyjny. Oba filtry muszą być używane razem.
Istnieją dwa rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych pod względem ich dróg optycznych:
1. Transmisyjny mikroskop fluorescencyjny: Źródło światła wzbudzającego przechodzi przez materiał próbki przez soczewkę kondensora w celu wzbudzenia fluorescencji. Powszechnie stosuje się kolektor ciemnego pola, a zwykłego kolektora można również użyć do ustawienia lustra w taki sposób, aby światło wzbudzenia zostało przekierowane i ominięte do preparatu. To jest starszy mikroskop fluorescencyjny. Zaletą jest to, że fluorescencja jest silna przy małym powiększeniu, ale wadą jest to, że fluorescencja zmniejsza się wraz ze wzrostem powiększenia. Dlatego lepiej jest obserwować większe próbki materiałów.
2. Mikroskop epifluorescencyjny to nowy typ mikroskopu fluorescencyjnego opracowany w czasach nowożytnych. Różnica polega na tym, że światło wzbudzenia pada z soczewki obiektywu na powierzchnię próbki, to znaczy ta sama soczewka obiektywu jest używana jako kondensator oświetlenia i soczewka obiektywu do zbierania fluorescencji. Dichroiczny rozdzielacz wiązki należy dodać na ścieżce światła, która jest oddalona o 45 stopni od lekkiego uranu. Światło wzbudzenia jest odbijane do soczewki obiektywu i zbierane na próbce. Fluorescencja generowana przez próbkę i światło wzbudzenia odbite przez powierzchnię soczewki obiektywu i powierzchnię szkła nakrywkowego wchodzą jednocześnie do soczewki obiektywu i wracają do dwukolorowego rozdzielacza wiązki, aby światło wzbudzenia było oddzielone od fluorescencji resztkowe światło wzbudzenia jest pochłaniane przez filtry blokujące. Takie jak zmiana na kombinację różnych filtrów wzbudzenia / dwukolorowego rozdzielacza wiązki / filtra blokującego, może zaspokoić potrzeby różnych produktów reakcji fluorescencyjnych. Zaletą tego rodzaju mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że oświetlenie pola widzenia jest równomierne, obraz jest wyraźny, a im większe powiększenie, tym silniejsza fluorescencja.
(2) Jak korzystać z mikroskopu fluorescencyjnego.
1. Włącz źródło światła, a ultrawysokociśnieniowa lampa rtęciowa musi rozgrzewać się przez kilka minut, aby osiągnąć najjaśniejszy punkt.
2. Transmisyjny mikroskop fluorescencyjny musi zainstalować wymagany filtr wzbudzenia między źródłem światła a kondensatorem oraz zainstalować odpowiedni filtr blokujący za soczewką obiektywu. Mikroskopy epi-fluorescencyjne wymagają wkładania wymaganego filtra wzbudzenia/dwukolorowego rozdzielacza wiązki/filtra blokującego do szczelin w ścieżce optycznej.
3. Obserwuj przez soczewkę o małym powiększeniu i wyreguluj środek źródła światła tak, aby znajdowało się ono w środku całego punktu świetlnego zgodnie z urządzeniem regulacyjnym różnych modeli mikroskopów fluorescencyjnych.
4. Umieść fragment preparatu i obserwuj po ogniskowaniu. Podczas użytkowania należy zwrócić uwagę: nie obserwować bezpośrednio z filtrem końcowym, aby nie uszkodzić oczu; podczas obserwacji preparatów soczewką olejową należy używać specjalnej soczewki olejowej bez fluorescencji; po wyłączeniu wysokociśnieniowej lampy rtęciowej nie można jej natychmiast ponownie włączyć, należy ją przetestować. Można go ponownie uruchomić po 5 minutach, w przeciwnym razie będzie niestabilny i wpłynie na żywotność lampy rtęciowej.
(3) Obserwacja Używając filtra światła niebiesko-fioletowego pod mikroskopem fluorescencyjnym na platformie dydaktycznej, można zauważyć, że o. 01% komórek wybarwionych oranżem akrydynowym, jądro i cytoplazma są pobudzone do wytworzenia dwóch różnych kolorów fluorescencji (ciemnozielonego i pomarańczowo-czerwonego).
