Zwiększanie korzyści płynących ze skaningowej mikroskopii wielofotonowej
Laserowa skaningowa mikroskopia wielofotonowa stanowi znaczący postęp w stosunku do mikroskopii optycznej. Potrafi obserwować głęboką strukturę żywych komórek, utrwalonych komórek i tkanek oraz może uzyskać wyraźne i ostre wielowarstwowe struktury w płaszczyźnie Z, czyli przekroje optyczne, z których może zbudować trójwymiarową stałą strukturę próbki. Mikroskopia konfokalna wykorzystuje laserowe źródło światła, które po rozszerzeniu wypełnia całą tylną płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu, a następnie przechodzi przez układ soczewek obiektywu, zbiegając się w bardzo mały punkt na płaszczyźnie ogniskowej próbki. W zależności od apertury numerycznej obiektywu średnica najjaśniejszego punktu oświetleniowego wynosi około 0,25 ~ 0,8 μm, a głębokość około 0,5 ~ 1,5 μm . Rozmiar plamki konfokalnej zależy od konstrukcji mikroskopu, długości fali lasera, charakterystyki soczewki obiektywu, ustawień stanu jednostki skanującej i właściwości próbki. Mikroskopia polowa charakteryzuje się dużym zakresem oświetlenia i głębokością, podczas gdy mikroskopia konfokalna charakteryzuje się oświetleniem skupionym skupionym na ognisku w płaszczyźnie ogniskowej. Najbardziej podstawową zaletą mikroskopii konfokalnej jest to, że umożliwia ona dokładne cięcie optyczne grubych próbek fluorescencyjnych (które mogą sięgać 50 μm lub więcej), a grubość skrawków wynosi około 0,5 do 1,5 μm. Serię obrazów przekroju optycznego można uzyskać, przesuwając preparat w górę i w dół za pomocą silnika krokowego osi Z mikroskopu. Pozyskiwanie informacji o obrazie jest kontrolowane w płaszczyźnie i nie będzie zakłócane przez sygnały emitowane z innych miejsc próbki. Po usunięciu wpływu fluorescencji tła i zwiększeniu stosunku sygnału do szumu kontrast i rozdzielczość obrazów konfokalnych ulegają znacznej poprawie w porównaniu z tradycyjnymi obrazami fluorescencyjnymi oświetlanymi w polu. W wielu okazach wiele skomplikowanych elementów konstrukcyjnych jest ze sobą splecionych, tworząc złożone systemy, ale gdy uda się zgromadzić wystarczającą liczbę przekrojów optycznych, możemy je zrekonstruować w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania. Ta metoda eksperymentalna jest szeroko stosowana w badaniach biologicznych w celu wyjaśnienia złożonych powiązań strukturalnych i funkcjonalnych między komórkami lub tkankami.
