Ile wiesz o mikroskopii fluorescencyjnej
Mikroskopy fluorescencyjne na ogół wykorzystują lampy rtęciowe o dużej intensywności jako źródła światła wzbudzającego. Filtry służą do odfiltrowania niepożądanego światła, pozostawiając jedynie czyste światło o wysokiej intensywności, które pobudza fluorofor. Po tym, jak światło monochromatyczne napromieniuje próbkę przez soczewkę obiektywu, próbka zostanie wzbudzona w celu wyemitowania światła (fluorescencja), a zarówno fluorescencja, jak i światło wzbudzenia powrócą wzdłuż ścieżki optycznej soczewki obiektywu. W takim przypadku do filtrowania światła wzbudzenia wymagane jest lustro dichroiczne. , przepuszczając tylko fluorescencję, której potrzebujemy.
Ta fluorescencja dociera do okularu wzdłuż drogi światła mikroskopu, a następnie trafia do naszych oczu, gdzie możemy zobaczyć fluorescencję emitowaną przez fluorofor.
Wstępna kontrola i regulacja mikroskopu fluorescencyjnego:
(1) Przed każdą obserwacją fluorescencji konieczne jest rutynowe sprawdzanie ustawienia żarnika, ogniska ścieżki optycznej, przesłony aperturowej i przesłony polowej urządzenia fluorescencyjnego.
(2) Czy wymagany zespół filtra wzbudzenia/emisji fluorescencji został zainstalowany w konwerterze, czy obiektyw mikroskopu fluorescencyjnego jest prawidłowo skonfigurowany oraz czy usunąć plamy oleju i kurz z przedniej soczewki obiektywu.
(3) Jeżeli obserwacja światła przechodzącego z kontrastem fazowym jest prowadzona w tym samym czasie, konieczne jest sprawdzenie sprzężenia środka kondensora z pierścieniem kontrastu fazowego naprzeciw soczewki obiektywu.
(4) Sprawdź, czy nośnik próbki (szkiełko na szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe i inne przybory) nie jest pokryty cieczą lub kurzem oraz czy grubość mieści się w skalibrowanym zakresie odległości roboczej obiektywu. Pocięta próbka nie powinna być zbyt gruba, najlepiej mniejsza lub równa 10 μm.
(5) Ponieważ źródło światła zawiera promienie ultrafioletowe, nad przednią częścią sceny umieszczona jest brązowa płytka chroniąca przed światłem, aby zapobiec uszkodzeniu siatkówki przez promienie ultrafioletowe.
(6) Niestabilność napięcia skraca żywotność wysokociśnieniowej lampy rtęciowej, a zasilacz źródła światła jest wyposażony w stabilizator napięcia.
(7) Aby przedłużyć żywotność lampy rtęciowej, można ją wyłączyć po 15 minutach od włączenia; po wyłączeniu mocy fluorescencyjnej lampy rtęciowej należy odczekać co najmniej 10 minut, aby ponownie włączyć opary rtęci, aby ostygły i powróciły do pierwotnego stanu, w przeciwnym razie wpłynie to na żywotność lampy.
Obserwacja obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym:
(1) Około 5-10 minut po włączeniu źródła światła fluorescencyjnego intensywność światła wzbudzającego jest stabilna i próbka jest ładowana do obserwacji; aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji próbki spowodowanej nadmiernym światłem wzbudzającym podczas ogniskowania i szukania obiektów, należy najpierw oddalić mikroskop fluorescencyjny. Ustawić światło wzbudzające na umiarkowane natężenie za pomocą przysłony aperturowej lub dodać filtr ND, a następnie regularnie przesuwaj stolik z próbkami. Po potwierdzeniu lustrzanego odbicia ustaw tryb fluorescencyjny na potrzeby fotografowania i nagrywania.
(2) Korekty dla słabej jakości obrazu. Oprócz czynników przygotowania próbki, niezbędne korekty, które można wprowadzić, to:
① Wyklucz urządzenia osłaniające lub ograniczające światło w ścieżce optycznej obrazowania, takie jak akcesoria DIC, filtry ND itp.
②Dostosuj ponownie ostrość odbiornika i rozmiar diafragmy apertury mikroskopu fluorescencyjnego.
③ Ostrożnie wyreguluj pierścień korekcji różnicy pokrycia obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego.
Punkty aplikacyjne mikroskopii fluorescencyjnej
Mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje obrazowanie „fluorescencji aktynicznej”. Jeśli wybrana długość fali wzbudzenia znajduje się w obszarze bliskiego ultrafioletu (320-400} nm), który jest niewidoczny gołym okiem, widmo emisji fluorescencji jest również krótsze niż średnia długość fali zwykłych zwierciadeł światła. poprawić. Fotony o wysokiej energii zderzają się z elektronami, powodując przejście elektronów ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego. Elektrony w stanie wzbudzonym są bardzo niestabilne i wracają do stanu podstawowego. W procesie tym część energii cieplnej zostanie zużyta i wyemitowane zostaną nowe fotony. Nowy foton ma niższą energię niż pierwotny foton i dlatego ma dłuższą długość fali. Ponieważ długość fali nowego fotonu różni się od długości fali fotonu padającego światła, dwie wiązki światła o różnych długościach fal są rozdzielane za pomocą określonej metody przetwarzania optycznego, tak że widzimy tylko wyemitowane nowe fotony (sygnał fluorescencji), to znaczy mikroskop fluorescencyjny widzi obrazy fluorescencyjne.
