Wprowadzenie do mikroskopii fluorescencyjnej
Mikroskopia fluorescencyjna polega na napromieniowaniu obiektu barwionego fluoresceiną światłem o krótkiej długości fali, tak aby wzbudził on fluorescencję o dużej długości fali, a następnie obserwował. W mikroskopie fluorescencyjnym światło wzbudzenia o określonej długości fali należy wybrać ze światła oświetlającego próbkę, aby wygenerować fluorescencję, a następnie fluorescencję należy oddzielić od światła mieszanego światła wzbudzenia i fluorescencji w celu obserwacji. Dlatego system filtrów odgrywa niezwykle ważną rolę w doborze określonej długości fali. Mikroskopy fluorescencyjne są szeroko stosowane w biologii, medycynie i innych dziedzinach.
1. Główne elementy mikroskopu fluorescencyjnego:
(A) Źródło światła: Źródło światła emituje światło o różnych długościach fal (od ultrafioletu do podczerwieni). the
(B) Źródło światła z filtrem wzbudzenia: przez światło o określonej długości fali, które może spowodować, że próbka wytworzy fluorescencję, blokując jednocześnie światło, które jest bezużyteczne dla wzbudzenia fluorescencji. the
(C) Próbki fluorescencyjne: zwykle barwione pigmentami fluorescencyjnymi. the
(D) Filtr blokujący: blokuje światło wzbudzenia, które nie jest pochłaniane przez próbkę i selektywnie przepuszcza fluorescencję, a niektóre długości fal są selektywnie przepuszczane we fluorescencji.
the
2. Klasyfikacja mikroskopów fluorescencyjnych:
Mikroskopy fluorescencyjne są ogólnie podzielone na dwa typy: transmisyjne i epiemisyjne:
A. Typ transmisji: światło wzbudzenia pochodzi z dolnej części badanego obiektu, a kondensator jest kondensatorem ciemnego pola, dzięki czemu światło wzbudzenia nie wchodzi do soczewki obiektywu, ale fluorescencja wchodzi do soczewki obiektywu. Jest jasny przy małych powiększeniach, ale ciemny przy dużych powiększeniach. Trudno jest pracować w zanurzeniu i centrowaniu oleju. Szczególnie trudno jest określić zakres oświetlenia przy małych powiększeniach, ale można uzyskać bardzo ciemne tło pola widzenia. Typ transmisji nie jest używany dla obiektów nieprzezroczystych. the
B. Epi-type: Typ transmisji jest obecnie prawie wyeliminowany. Większość nowych mikroskopów fluorescencyjnych jest typu epi. Źródło światła pochodzi znad kontrolowanego obiektu, a na ścieżce optycznej znajduje się rozdzielacz wiązki, dzięki czemu nadaje się do sprawdzania zarówno przezroczystych, jak i nieprzezroczystych obiektów. Ponieważ obiektyw działa jak soczewka kondensorowa, jest nie tylko łatwy w obsłudze, ale także zapewnia równomierne oświetlenie całego pola widzenia od małego powiększenia do dużego powiększenia. the
the
3. Środki ostrożności dotyczące fluoroskopii
A. Długotrwałe napromieniowanie światłem wzbudzającym spowoduje tłumienie i wygaszanie fluorescencji, dlatego skróć czas obserwacji tak bardzo, jak to możliwe i użyj przegrody, aby zakryć światło wzbudzenia, gdy chwilowo nie prowadzisz obserwacji. the
B. Podczas obserwacji za pomocą soczewek olejowych należy używać „oleju niefluorescencyjnego”. the
C. Fluorescencja jest prawie zawsze słaba i powinna być przeprowadzana w ciemnym pomieszczeniu. the
D. Najlepiej zamontować w zasilaczu stabilizator napięcia, inaczej niestabilne napięcie nie tylko skróci żywotność lampy rtęciowej, ale również wpłynie na efekt oględzin mikroskopowych. the
the
4. Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej
1. Wymagania dotyczące przygotowania preparatów do mikroskopu fluorescencyjnego
A. Szklana zjeżdżalnia
Grubość szkiełka powinna wynosić od 0,8 do 1,2 mm. Zbyt gruby preparat z jednej strony pochłonie więcej światła, az drugiej strony światło wzbudzenia nie może być skoncentrowane na preparacie. Szkiełka muszą być gładkie, jednolitej grubości i wolne od oczywistej autofluorescencji. Czasami stosuje się szkiełka kwarcowe. the
B. Szklana pokrywa
Grubość szkiełka nakrywkowego wynosi około 0,17 mm, gładkie. W celu wzmocnienia światła wzbudzającego można również zastosować suche szkło nakrywkowe, czyli specjalne szkło nakrywkowe pokryte kilkoma warstwami substancji (np. fluorescencja idzie gładko. Światło wzbudzenia jest przepuszczane, a odbite światło wzbudzenia wzbudza próbkę. the
C. Próbka
Plasterki tkanki lub inne próbki nie powinny być zbyt grube. Jeśli jest zbyt gruba, większość światła wzbudzenia zostanie pochłonięta w dolnej części preparatu, podczas gdy górna część obserwowana bezpośrednio przez obiektyw nie może być w pełni wzbudzona. Ponadto komórki nakładają się lub zakrywają zanieczyszczenia, co wpływa na ocenę. the
D. Środek montażowy
Gliceryna jest powszechnie stosowana jako środek montażowy, który nie może mieć autofluorescencji, jest bezbarwny i przezroczysty, a jasność fluorescencji jest jaśniejsza przy pH 8.{1}},5 i nie jest łatwa do szybkiego wyblaknięcia. Dlatego jako środek utrwalający powszechnie stosuje się równą mieszaninę glicerolu i 0,5 mol/l buforu węglanowego o pH od 9,{6}} do 9,5. the
mi. olej lustrzany
Ogólnie olejek immersyjny musi być używany podczas obserwacji preparatów za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych ciemnego pola i obiektywów immersyjnych z olejkiem immersyjnym. Najlepiej użyć specjalnego niefluorescencyjnego oleju lustrzanego, który również można zastąpić wspomnianą gliceryną, można też zastosować ciekłą parafinę, ale współczynnik załamania światła jest niski, co nieznacznie wpływa na jakość obrazu.
