Metody wydłużania ogniskowej mikroskopów wielofotonowych
Połączenie dwu-laserowego mikroskopu skaningowego fotonowego i wskaźnika wapnia to złoty standard w wykrywaniu sygnałów neuronowych in vivo. Neurony w sieciach neuronowych są rozmieszczone w-przestrzeni trójwymiarowej, a monitorowanie dynamiki ich aktywności wymaga szybkiego poprawienia szybkości obrazowania objętościowego. Jednakże w przypadku użycia siatkowego skaningowego mikroskopu wielofotonowego do obrazowania dużej liczby obrazów, jeśli w celu uzyskania wyższej rozdzielczości bocznej zostanie zastosowany obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA), uzyska się mniejszą głębokość ogniskowej. Aby uzyskać obrazowanie objętościowe na małej głębokości ogniskowej,
Konieczne jest wykonanie skanowania osi Z-w jakiś sposób, obrazowanie wielu płaszczyzn poprzez skanowanie każdej płaszczyzny ogniskowej, co znacznie ogranicza prędkość obrazowania. Jeśli można poświęcić informacje o obrazie osiowym i uzyskać skanowanie objętości w jednym skanie bocznym poprzez zwiększenie głębi ostrości, czyli rzutowanie informacji o objętości na pojedynczy obraz 2D, prędkość obrazowania można znacznie poprawić. Nazywa się to obrazowaniem o rozszerzonej głębi ostrości (EDF), które jest szczególnie przydatne do obrazowania rzadkich struktur populacji, które wymagają wysokiej rozdzielczości czasowej, takich jak funkcjonalne obrazowanie aktywności neuronów.
Rozdzielczość osiowa i poprzeczna mikroskopu zależy od apertury numerycznej (NA) soczewki obiektywu. Wysoka NA może zmaksymalizować rozdzielczość osiową i poprzeczną, a także ilość zebranego światła; Niższa wartość NA spowoduje niższą rozdzielczość osiową, tj. dłuższą głębię ostrości, ale jednocześnie wpłynie na rozdzielczość boczną i wydajność zbierania światła. Wprowadzona dalej metoda zwiększania głębi ostrości może to osiągnąć przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości bocznej i wystarczającego strumienia świetlnego.
Zastosowanie przestrzennych modulatorów światła do generowania ogniskowych smukłych wiązek Bessela może umożliwić obrazowanie EDF, ale przestrzenne modulatory światła są nieporęczne i trudno je dopasować do wąskich przestrzeni mikroskopu; Natomiast moduły Bessela oparte na piramidach osiowych są tanie i kompaktowe, ale potrafią generować jedynie ogniska o ustalonej głębokości i nie nadają się do różnych eksperymentów wymagających ciągłych zmian głębi ogniskowej. Aby rozwiązać ten problem, w 2018 r. RONGWEN LU i in. zademonstrował moduł Bessela oparty na aksikonie, w którym tylko jedna soczewka wymaga przesunięcia wzdłuż osi optycznej, aby w sposób ciągły regulować długość osiową ogniska Bessela.
Rysunek 1 (a) Schemat urządzenia modułu Bessela; (b) Funkcja rozproszenia punktów została zmierzona eksperymentalnie, gdy D wynosiło odpowiednio -12 mm, 0 mm i 12 mm; (c) Zależność pomiędzy pełną szerokością poprzeczną w połowie maksimum, (d) pełną szerokością osiową w połowie maksimum, (e) sygnałem szczytowym i (f) mocą optyczną za soczewką obiektywu przy przemieszczeniu L2 D
Urządzenie modułowe do formowania ogniska Bessela o zmiennej długości pokazano na rysunku 1a. Padająca wiązka Gaussa po przejściu przez aksikon i soczewkę L1 ma kształt okrągłej wiązki. Następna maska apertury kołowej może blokować światło rozproszone spowodowane defektami aksikonu, kształtując w ten sposób rozkład osiowy funkcji rozproszenia punktu wzbudzenia dwóch-fotonów. Następnie wiązka światła rzucana jest na galwanometr przez soczewki L2 i L3, a następnie poprzez soczewki L4 i L5 dociera do tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu.
Konstrukcje te są podobne do tradycyjnych modułów opartych na piramidach, z tą różnicą, że przesuwając L2 lub L3 wzdłuż osi optycznej, można płynnie regulować długość osiową ogniska Bessela. Rysunek 1b przedstawia funkcje rozrzutu punktów osiowych dla wartości D wynoszących -12 mm, 0 mm i 12 mm, przy pełnej szerokości osiowej w połowie maksimum wynoszącej 39? m, 24? M i 14? M. Jak pokazano na rysunku 1c-f, przesuwanie soczewki L2 od lewej do prawej może w sposób ciągły zmieniać pełną szerokość o połowę maksymalnie, zarówno w kierunku poprzecznym, jak i osiowym, co oznacza, że głębię ostrości można zmieniać w sposób ciągły. Wyniki symulacji numerycznych opartych na teorii dyfrakcji wektorów są dobrze zgodne z danymi eksperymentalnymi. Rycina 2 weryfikuje efekt korekcji różnych rozmiarów masek pierścieniowych na defekty aksikonu. Stwierdzono, że cieńsze maski pierścieniowe mogą lepiej optymalizować osiowy rozkład natężenia wyjściowej wiązki Bessela, ale jednocześnie prowadzą również do większych strat mocy.
