Obrazowanie w mikroskopie wielofotonowym: różne techniki obrazowania neuronów in vivo
W porównaniu z tradycyjnym jednofotonowym szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym, mikroskopia wielofotonowa (MPM) ma funkcje cięcia optycznego i głębokiego obrazowania. W 2019 roku Jerome Lecoq i in. omówili powiązaną technologię MPM z trzech aspektów: obrazowanie neuronów głęboko w mózgu, obrazowanie masywnych neuronów i obrazowanie neuronów o dużej szybkości.
Aby powiązać aktywność neuronów ze złożonym zachowaniem, zwykle konieczne jest zobrazowanie neuronów w korze głębokiej, co wymaga, aby MPM miał zdolność głębokiego obrazowania. Światło wzbudzenia i emisji będzie silnie rozproszone i pochłonięte przez tkankę biologiczną, co jest głównym czynnikiem ograniczającym głębokość obrazowania MPM. Chociaż problem rozpraszania można rozwiązać, zwiększając intensywność lasera, spowoduje to inne problemy, takie jak spalanie próbki, rozogniskowanie i wzbudzenie fluorescencji przy powierzchni. Najlepszym sposobem na zwiększenie głębi obrazowania MPM jest użycie dłuższych fal jako światła wzbudzającego.
Ponadto w przypadku obrazowania dwufotonowego (2P) wzbudzenie fluorescencji poza ogniskiem i blisko powierzchni jest dwoma największymi czynnikami ograniczającymi głębokość, podczas gdy w przypadku obrazowania trójfotonowego (3P) te dwa problemy są znacznie zmniejszone, ale obrazowanie trójfotonowe dzięki fluorescencji Przekrój poprzeczny absorpcji grupy jest znacznie mniejszy niż w przypadku 2P, więc energia impulsu o rząd wielkości jest wyższa, aby uzyskać sygnał fluorescencji o takim samym natężeniu, jak ten wzbudzony przez 2P. Funkcjonalna mikroskopia 3P jest bardziej wymagająca niż strukturalna mikroskopia 3P, która wymaga szybszego skanowania w celu pobrania próbki aktywności neuronów w czasie; wymagana jest wyższa energia impulsu, aby zebrać wystarczającą ilość sygnałów w czasie przebywania każdego piksela.
Złożone zachowania często obejmują duże sieci mózgowe z połączeniami zarówno lokalnymi, jak i dalekosiężnymi. Aby powiązać aktywność neuronów z zachowaniem, konieczne jest jednoczesne monitorowanie aktywności bardzo dużych i szeroko rozmieszczonych neuronów. Sieć neuronowa w mózgu przetwarza napływające bodźce w ciągu dziesiątek milisekund. Aby zrozumieć tę szybką sieć neuronową Aby badać dynamikę neuronów, MPM musi mieć możliwość szybkiego obrazowania neuronów. Metody szybkiego MPM można podzielić na techniki skanowania jednowiązkowego i techniki skanowania wielowiązkowego.
Technologia skanowania pojedynczą wiązką umożliwia szybkie przechodzenie przez tkankę nerwową z dużym polem widzenia (FOV)
Podczas korzystania z MPM do obrazowania neuronów, skanowanie o dostępie swobodnym — czyli wiązka laserowa jest szybko skanowana w dowolnym wybranym punkcie w całym polu widzenia — może skanować tylko neurony będące przedmiotem zainteresowania, co nie tylko pozwala uniknąć skanowania jakichkolwiek nieoznakowanych włókien nerwowych, które mogą zoptymalizować również czas skanowania wiązki laserowej. Skanowanie o dostępie swobodnym (ryc. 1) można uzyskać za pomocą deflektora akustyczno-optycznego (AOD), który działa poprzez połączenie przetwornika piezoelektrycznego z sygnałem o częstotliwości radiowej z odpowiednim kryształem. Powstałe fale akustyczne indukują okresową siatkę współczynnika załamania światła. Dyfrakcja występuje, gdy wiązka lasera przechodzi przez siatkę. Intensywność i częstotliwość fali dźwiękowej można regulować za pomocą sygnału elektrycznego o częstotliwości radiowej, aby zmienić intensywność i kierunek ugiętego światła, dzięki czemu można zrealizować jednowymiarowe poziome skanowanie dowolnych punktów za pomocą jednego AOD, a 3D można zrealizować za pomocą pary AOD w połączeniu z innymi technologiami skanowania osiowego, skanowaniem o swobodnym dostępie. Jednak ta technika jest bardzo wrażliwa na ruch próbki i podatna na artefakty ruchu. Obecnie szeroko stosowane jest szybkie skanowanie rastrowe, czyli skanowanie progresywne w FOV, ponieważ algorytm może z łatwością rozwiązać artefakty ruchu.
Obrazowanie dwufotonowe neuronów kory nowej L2/3 in vivo w oparciu o AOD[2]
Istnieje wiele sposobów realizacji szybkiego skanowania rastrowego, przy użyciu wibrującego lustra do szybkiego skanowania 2D, połączenia wibrującego lustra i regulowanej soczewki elektrycznej do szybkiego skanowania 3D, ale regulowana soczewka elektryczna nie może szybko ustawić ostrości w kierunku osiowym ze względu na ograniczenia bezwładność mechaniczna Przełączanie, które wpływa na szybkość obrazowania, można teraz zastąpić przestrzennym modulatorem światła (SLM).
Zdalne ustawianie ostrości jest również sposobem na uzyskanie obrazu 3D, jak pokazano na rysunku 2. W module LSU galwanometr skanujący skanuje poziomo, a moduł ASU zawiera soczewkę obiektywu L1 i lustro M, a skanowanie osiowe jest realizowane poprzez regulację położenie M. Ta technika może nie tylko skorygować aberrację optyczną wprowadzoną przez główny obiektyw L2, ale także umożliwić szybkie skanowanie osiowe. Aby uzyskać więcej obrazowania neuronów, FOV można powiększyć, dostosowując konstrukcję soczewki obiektywu mikroskopu, ale soczewka obiektywu z dużym NA i dużym FOV jest zwykle ciężka i nie może się szybko poruszać w celu szybkiego skanowania osiowego, więc duże systemy FOV opierają się na Telefocus , SLM i regulowane soczewki zmotoryzowane.
Schemat ideowy systemu obrazowania dwufotonowego ze zdalnym ogniskowaniem [3] Technologia skanowania wielowiązkowego może jednocześnie obrazować różne pozycje tkanki nerwowej
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm od siebie) miejsc obrazowania (ryc. 3C, D); w przypadku sąsiednich obszarów zwykle wykorzystuje wiele wiązek pojedynczej soczewki obiektywu do obrazowania (ryc. 3E, F). W technice skanowania wielowiązkowego należy zwrócić szczególną uwagę na problem przesłuchu między wiązkami wzbudzającymi, który można rozwiązać metodą separacji poźródeł światła lub metodą multipleksowania czasoprzestrzennego. Metoda separacji źródeł światła post-hoc odnosi się do wykorzystania algorytmów do rozdzielania wiązek w celu wyeliminowania przesłuchu; metoda multipleksowania czasoprzestrzennego odnosi się do jednoczesnego wykorzystania wielu wiązek wzbudzających, impulsy każdej wiązki są opóźniane w czasie, tak że poszczególne wiązki wzbudzane różnymi wiązkami mogą być tymczasowo rozdzielone. sygnał fluorescencyjny. Więcej neuronów można zobrazować, wprowadzając więcej wiązek, ale wiele wiązek zwiększy nakładanie się czasu zaniku fluorescencji, co ogranicza możliwość rozróżnienia źródeł sygnału; multipleksowanie ma negatywny wpływ na szybkość pracy urządzeń elektronicznych. Wysokie wymagania; duża liczba wiązek wymaga również większej mocy lasera, aby zachować przybliżony stosunek sygnału do szumu pojedynczej wiązki, co może łatwo doprowadzić do uszkodzenia tkanki.
Technologia obrazowania wielkopowierzchniowego
W ostatnich latach rozwój różnych technologii MPM poszerzył zakres naszego obrazowania tkanki nerwowej, umożliwiając nam obrazowanie większej liczby neuronów głęboko w mózgu z większą prędkością, co znacznie promowało badania neuronaukowe i umożliwiło nam uzyskanie lepszego zrozumienia funkcji mózgu.
