Przygotowanie i obserwacja próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej
Rozdzielczość mikroskopu zależy od długości fali użytego światła. Mikroskop elektronowy, który zaczął pojawiać się w 1933 roku, wykorzystuje jako źródło światła wiązkę elektronów o długości fali znacznie krótszej niż światło widzialne, dzięki czemu osiągana przez nią rozdzielczość jest znacznie lepsza w porównaniu z rozdzielczością mikroskopu optycznego. Różnica w źródłach światła determinuje także szereg różnic pomiędzy mikroskopami elektronowymi i mikroskopami optycznymi.
W związku z różnicami w zasadach obrazowania wiązką elektronów i różnymi sposobami oddziaływania na próbki, współczesne mikroskopy elektronowe rozwinęły się w wiele typów. Obecnie najczęściej stosowanymi są mikroskopy elektronowe transmisyjne i mikroskopy elektronowe skaningowe. Całkowite powiększenie tego pierwszego może wynosić od 1000-1000000. Całkowite powiększenie tego ostatniego może wahać się od 20 do 300000 razy. Doświadczenie to polega głównie na przygotowaniu dwóch rodzajów próbek mikroskopowych, transmisyjnego mikroskopu elektronowego i skaningowego mikroskopu elektronowego.
2. Sprzęt
1. Skos bakterii Escherichia coli (Escherichia coli).
2. Roztwór lub odczynnik octan amylu, stężony kwas siarkowy, etanol absolutny, woda sterylna, 2% fosforan wolframianu sodu (pH 6.5-8.0) roztwór wodny, 0.3% polietylen roztwór formaldehydu (rozpuszczalny w chloroformie), komórki Pigment c, octan amonu, plazmid pBR322.
3. Przyrządy lub inne przybory: zwykły mikroskop optyczny, siatka miedziana, lejek porcelanowy, zlewka, naczynie, sterylny zakraplacz, sterylna pęseta, szpilki, szkiełka, tablica licząca, maszyna do powlekania próżniowego, suszarka do punktu krytycznego itp.
3. Etapy operacji
(1) Przygotowanie próbek i obserwacja do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
1. Obróbka siatki metalowej
Próbkę do mikroskopii optycznej umieszcza się na szkiełku w celu obserwacji. Jednakże w transmisyjnej mikroskopii elektronowej, ponieważ elektrony nie mogą przeniknąć przez taflę szklaną, materiały siatkowe można stosować jedynie jako nośniki, zwane zwykle siatkami nośnymi. Siatkę nośną można podzielić na wiele różnych specyfikacji ze względu na różne materiały i kształty, spośród których najczęściej stosowaną jest siatka miedziana 200-400 (liczba otworów). Siatkę miedzianą należy poddać obróbce przed użyciem, aby usunąć brud i utrzymać ją w czystości, w przeciwnym razie będzie to miało wpływ na jakość folii nośnej i klarowność zdjęć próbek. W tym eksperymencie wykorzystano siatkę miedzianą 400-mesh, którą można poddać obróbce w następujący sposób: najpierw namoczyć ją i wybielić octanem amylu przez kilka godzin, następnie kilkakrotnie przepłukać wodą destylowaną, a następnie namoczyć ją w absolutnym etanolu przez kilka godzin odwodnienie. Jeżeli po zastosowaniu powyższych metod siatka miedziana nadal nie jest czysta, można ją namoczyć w rozcieńczonym stężonym kwasie siarkowym (1:1) na 1-2 minuty lub gotować przez kilka minut w 1% roztworze NaOH, przepłukać destylowaną podlać kilka razy wodą, a następnie umieścić w bezwodnym odwodnieniu w etanolu i odstawić.
2. Przygotowanie membrany nośnej
Podczas obserwacji próbek należy również przykryć siatkę nośną warstwą nieustrukturyzowanej, jednolitej folii, w przeciwnym razie z otworów siatki nośnej będą wyciekać drobne próbki. Folia ta jest zwykle nazywana folią podporową lub folią nośną. Folia nośna powinna być przezroczysta dla elektronów, a jej grubość powinna na ogół być mniejsza niż 20 nm; pod wpływem wiązki elektronów folia powinna mieć również pewną wytrzymałość mechaniczną, aby zachować stabilność strukturalną i dobrą przewodność cieplną; dodatkowo w mikroskopii elektronowej należy zastosować siatkę nośną. Pod spodem nie powinna znajdować się widoczna struktura, nie może zachodzić reakcja chemiczna z przewożoną próbką ani zakłócać obserwacji próbki. Jego grubość wynosi zazwyczaj około 15 nm. Folią nośną może być folia z tworzywa sztucznego (taka jak folia kolodionowa, folia polietylenowo-formaldehydowa itp.), folia węglowa lub folia metalowa (taka jak folia berylowa itp.). W normalnych warunkach pracy folia z tworzywa sztucznego może spełnić wymagania. Wśród folii z tworzyw sztucznych folia kolodionowa jest stosunkowo łatwa w przygotowaniu, ale jej wytrzymałość nie jest tak dobra jak folia polietylenowo-formaldehydowa.
