Zasada i budowa mikroskopu fluorescencyjnego
Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje punktowe źródło światła o wysokiej wydajności świetlnej, które emituje określoną długość fali światła (np. światło ultrafioletowe 3650 cali lub fioletowo-niebieskie światło 4200 cali) przez system filtrowania kolorów jako światło wzbudzające i wzbudza substancje fluorescencyjne w próbce do emitują różne kolory fluorescencji. Następnie obserwuje się go przez powiększenie obiektywu i okularu. W ten sposób, nawet przy słabej fluorescencji, jest łatwo rozpoznawalny i bardzo czuły na silnie kontrastującym tle, używany głównie do badania struktury i funkcji komórek, a także składu chemicznego. Podstawowa struktura mikroskopu fluorescencyjnego składa się ze zwykłego mikroskopu optycznego i niektórych akcesoriów (takich jak fluorescencyjne źródło światła, filtr wzbudzenia, bichromatyczny separator wiązek i filtr blokujący itp.). Fluorescencyjne źródła światła - zwykle wykorzystują ultrawysokociśnieniowe lampy rtęciowe (50-200W), które mogą emitować światło o różnych długościach fal. Jednakże każda substancja fluorescencyjna ma długość fali światła wzbudzenia, która wytwarza najsilniejszą fluorescencję, dlatego należy dodać filtry wzbudzenia (zwykle filtry wzbudzenia ultrafioletowego, fioletowego, niebieskiego i zielonego), aby umożliwić przejście i oświetlenie tylko określonej długości fali światła wzbudzenia próbki, pochłaniając jednocześnie całe inne światło. Każda substancja po naświetleniu światłem wzbudzonym emituje widzialną fluorescencję o większej długości fali niż naświetlanie w bardzo krótkim czasie. Fluorescencja ma swoistość i jest na ogół słabsza niż światło wzbudzające. Aby zaobserwować specyficzną fluorescencję, za soczewką obiektywu należy umieścić filtr blokujący (lub tłumiący). Ma dwie funkcje: po pierwsze, pochłania i blokuje przedostawanie się światła wzbudzenia do okularu, aby uniknąć zakłócania fluorescencji i uszkodzenia oczu; po drugie, wybiera i umożliwia przejście określonej fluorescencji, wyświetlając określony kolor fluorescencji. Obydwa typy filtrów należy wybrać, aby móc ich używać razem.
Istnieją dwa typy mikroskopów fluorescencyjnych w zależności od ich ścieżki optycznej:
1. Transmisyjny mikroskop fluorescencyjny: Źródło światła wzbudzającego przepuszczane jest przez materiał próbki przez kondensator w celu wzbudzenia fluorescencji. Powszechnie używane kolektory światła ciemnego pola lub zwykłe kolektory światła można zastosować do regulacji reflektora w celu konwersji światła wzbudzenia i światła bocznego na próbkę. Jest to stosunkowo staromodny mikroskop fluorescencyjny. Jego zaletą jest to, że fluorescencja jest silna przy małym powiększeniu, natomiast wadą jest to, że fluorescencja słabnie wraz ze wzrostem powiększenia. Dlatego lepiej jest obserwować większe próbki materiałów.
2. Mikroskop fluorescencyjny ze wiązką opadającą. Jest to nowy typ mikroskopu fluorescencyjnego opracowany w czasach nowożytnych. W przeciwieństwie do poprzedniego, światło wzbudzenia opada z soczewki obiektywu na powierzchnię próbki, wykorzystując tę samą soczewkę obiektywu, co kondensator oświetlający i soczewka obiektywu do zbierania fluorescencji. Do ścieżki optycznej ustawionej pod kątem 45 stopni w stosunku do lekkiego uranu należy dodać dwukolorowy separator wiązki. Światło wzbudzenia odbija się od soczewki obiektywu i skupia na próbce. Fluorescencja wytwarzana przez próbkę, a także światło wzbudzenia odbite od powierzchni soczewki obiektywu i szkła nakrywkowego, wchodzą jednocześnie do soczewki obiektywu i powracają do dichroicznego separatora wiązek, oddzielając wzbudzenie i fluorescencję. Wzbudzenie resztkowe jest następnie pochłaniane przez filtr blokujący. Jeśli stosowane są różne filtry wzbudzające/dwukolorowe separatory wiązek/kombinacje filtrów blokujących, mogą one zaspokoić potrzeby różnych produktów reakcji fluorescencyjnej. Zaletą tego mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że oświetlenie pola widzenia jest równomierne, obraz jest wyraźny, a im większe powiększenie, tym silniejsza fluorescencja.
