Techniki barwienia i obserwacja mikroskopowa mikroorganizmów
1. Cel
1.1 Naucz się podstawowych technik rozmazów i barwienia drobnoustrojów.
1.2 Opanuj prostą metodę barwienia bakterii.
1.3 Wstępne zrozumienie cech morfologicznych bakterii i utrwalenie wiedzy na temat stosowania soczewek olejowych i technik działania aseptycznego.
2 Zasady
Rozmazywanie i barwienie bakterii jest podstawową techniką w doświadczeniach mikrobiologicznych. Komórki bakteryjne są małe i przezroczyste, co utrudnia ich identyfikację pod zwykłym mikroskopem świetlnym; muszą być poplamione. Do barwienia bakterii stosuje się pojedynczy barwnik, dzięki czemu wybarwione bakterie wyraźnie różnią się kolorem od tła, dzięki czemu można lepiej obserwować ich morfologię i strukturę. Metoda ta jest łatwa w obsłudze i odpowiednia do obserwacji ogólnego kształtu komórek bakteryjnych i rozmieszczenia bakterii. Barwniki podstawowe są powszechnie stosowane do prostego barwienia. Dzieje się tak dlatego, że w roztworach obojętnych, zasadowych lub słabo kwaśnych komórki bakteryjne są zwykle naładowane ujemnie, a gdy barwniki zasadowe są zjonizowane, część barwiąca ich cząsteczek jest naładowana dodatnio, więc mają odczyn zasadowy. Barwiąca część barwnika łatwo łączy się z bakteriami, nadając im kolor. Zabarwione komórki bakteryjne ostro kontrastują z tłem, co ułatwia ich identyfikację pod mikroskopem. Barwniki powszechnie stosowane do prostego barwienia obejmują błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, zasadową fuksynę itp. Kiedy bakterie rozkładają cukry i wytwarzają kwas, powodując spadek pH pożywki hodowlanej, zwiększa się ładunek dodatni bakterii. W tym czasie do barwienia można stosować barwniki kwasowe, takie jak eozyna, kwaśna fuksyna lub czerwień Kongo. Przed barwieniem bakterie należy utrwalić. Ma dwa cele: jednym jest zabicie bakterii i spowodowanie ich przylegania do szkiełka; drugim jest zwiększenie ich powinowactwa do barwników. Dwie powszechnie stosowane metody to ogrzewanie i utrwalanie chemiczne. Podczas mocowania staraj się zachować oryginalny kształt komórek.
3 materiały
3.1 Bakterie: Bacillus subtilis 12-18h kultura na skosie na agarze odżywczym, Staphylococcus aureus 24-godzinna kultura na skosie na agarze odżywczym, Escherichia coli 24-godzinna kultura na skosie na agarze odżywczym, kultura na skosie na agarze z drożdżami piekarskimi.
3.2 Środek barwiący: zasadowy barwnik błękitu metylenowego Lu (lub fiolet krystaliczny szczawianu amonu), barwnik fuksyna kwasu karbolowego.
3.3 Instrumenty lub inne przybory: mikroskop, lampa alkoholowa, szkiełko, eza do inokulacji, stojak na szkiełka, butelka dwuwarstwowa (zawierająca olej cedrowy i ksylen), chusteczka do soczewek, sól fizjologiczna lub woda destylowana itp.
4. Proces: rozmaz → suszenie → utrwalenie → barwienie → mycie → suszenie → badanie mikroskopowe.
5 kroków
5.1 Rozmaz: Weź dwa czyste i wolne od oleju szkiełka. W sterylnych warunkach nałóż małą kroplę soli fizjologicznej (lub wody destylowanej) na każdy środek szklanego szkiełka. Do sterylizacji bakterii Bacillus subtilis użyj ezy inokulacyjnej. , Micrococcus luteus i Escherichia coli, wybierz odrobinę bakteryjnego trawnika w kropelkach wody na skosie, dobrze wymieszaj i nałóż cienką warstwę. Jeśli używasz rozmazu z zawiesiny bakteryjnej (lub płynnej hodowli), możesz użyć ezy do inokulacji, aby pobrać 2–3 ezy i nałożyć je bezpośrednio na szkiełko. Należy uważać, aby nie upuścić zbyt dużej ilości soli fizjologicznej (wody destylowanej) i usunąć bakterie, a następnie nałożyć ją równomiernie i niezbyt gęsto.
5.2 Suszenie Suszyć naturalnie w temperaturze pokojowej. Można go także lekko podgrzać nad lampą alkoholową, powlekaną stroną skierowaną do góry, aby go wysuszyć. Pamiętaj jednak, aby nie zbliżać się zbyt blisko płomienia, ponieważ zbyt wysoka temperatura zniszczy morfologię bakterii.
5.3 Utrwalanie Jeśli stosuje się suszenie z ogrzewaniem, utrwalanie i suszenie łączy się w jeden etap, a metoda jest taka sama jak suszenie. Rozmazać, osuszyć i utrwalić termicznie.
5.4 Barwienie: Umieścić szkiełko płasko na stojaku na szkiełka i dodać 1 do 2 kropli roztworu barwnika na rozmaz (odpowiednio, aby roztwór barwnika jedynie przykrywał błonę rozmazową). Barwić zasadowym błękitem metylenowym Lu przez 1 do 2 minut i barwić fuksyną kwasu karbolowego (lub fioletem krystalicznym szczawianu amonu) przez około 1 minutę.
5.5 Mycie wodą: Odlać roztwór barwnika i delikatnie spłukać wodą kranową z jednego końca szkiełka, aż woda spływająca z rozmazu stanie się bezbarwna. Podczas mycia wodą nie należy myć pomalowanej powierzchni bezpośrednio wodą. Przepływ wody nie powinien być zbyt szybki ani zbyt duży, aby zapobiec odpadaniu warstwy mazistej.
5.6 Suszenie: Strząśnij kropelki wody ze szkiełka i wysusz w naturalny sposób, wysusz suszarką do włosów lub zaabsorbuj chłonnym papierem (uważaj, aby nie wytrzeć bakterii). 5.7 Badanie mikroskopowe Po wyschnięciu rozmazu przeprowadzić badanie mikroskopowe. Przed oglądaniem przez soczewkę olejową rozmaz musi całkowicie wyschnąć.
6 Wyniki Narysuj morfologię E. coli i Micrococcus luteus zaobserwowaną po pojedynczym barwieniu.
