Charakterystyka techniczna i umiejętność obsługi dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego
Dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna to nowa technologia, która łączy laserową skaningową mikroskopię konfokalną i technologię wzbudzania dwufotonowego.
Podstawowa zasada wzbudzenia dwufotonowego jest następująca: w przypadku dużej gęstości fotonów cząsteczki fluorescencyjne mogą jednocześnie absorbować dwa fotony o dużej długości fali i emitować foton o mniejszej długości fali po krótkim okresie tzw. życia stanu wzbudzonego . ; Efekt jest taki sam, jak użycie fotonu o długości fali równej połowie długiej fali do wzbudzenia cząsteczki fluorescencyjnej. Wzbudzenie dwufotonowe wymaga dużej gęstości fotonów. Aby nie uszkodzić komórek, mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje wysokoenergetyczne lasery impulsowe z synchronizacją modów. Laser emitowany przez ten laser ma wysoką energię szczytową i niską energię średnią, jego szerokość impulsu wynosi zaledwie 100 femtosekund, a jego okres może sięgać od 80 do 100 megaherców. Gdy do ogniskowania fotonów lasera impulsowego używana jest soczewka obiektywu o dużej aperturze numerycznej, gęstość fotonów w ognisku soczewki obiektywu jest najwyższa, a wzbudzenie dwufotonowe występuje tylko w ognisku soczewki obiektywu, więc mikroskop dwufotonowy nie potrzebuje konfokalnego otworka, co poprawia skuteczność detekcji fluorescencji. Jest to ważna metoda badawcza w dziedzinie morfologii, biologii komórki molekularnej, neuronauki i farmakologii.
1. Tło powstania mikroskopii dwufotonowej – dwa ograniczenia tradycyjnej laserowej mikroskopii konfokalnej:
1) Jednym z nich jest zjawisko fototoksyczności: ponieważ otworek konfokalny musi być wystarczająco mały, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości, a mały otwór zablokuje dużą część fluorescencji emitowanej z próbki, w tym fluorescencję emitowaną z płaszczyzny ogniskowej, odpowiednie Tak, światło wzbudzenia musi być wystarczająco silne, aby uzyskać wystarczający stosunek sygnału do szumu; a laser o dużej intensywności spowoduje szybkie zanikanie barwnika fluorescencyjnego podczas ciągłego skanowania, a sygnał fluorescencyjny będzie coraz słabszy w miarę postępu skanowania.
2) Fototoksyczność to kolejny problem. Pod wpływem promieniowania laserowego wiele cząsteczek barwnika fluorescencyjnego będzie wytwarzać cytotoksyny, takie jak tlen singletowy lub wolne rodniki, więc czas skanowania i gęstość mocy optycznej światła wzbudzającego powinny być ograniczone w eksperymencie, aby utrzymać gęstość próbki. aktywny. W badaniach nad próbkami aktywnymi, zwłaszcza różnymi stadiami wzrostu i rozwoju próbek aktywnych, fotowybielanie i fototoksyczność powodują, że badania te są bardzo ograniczone.
2. Dlaczego twierdzisz, że mikroskopy dwufotonowe generalnie nie muszą być wyposażone w lasery wzbudzające w ultrafiolecie?
Mikroskopia dwufotonowa to technologia wzbudzania fluorescencji oparta na efekcie wzbudzenia dwufotonowego: cząsteczki barwnika fluorescencyjnego mogą być wzbudzane przez pochłanianie dwóch niskoenergetycznych fotonów w tym samym czasie (odstęp czasu między dwoma fotonami docierającymi do cząsteczek fluorescencyjnych jest mniejszy niż 1 femtosekunda ), jego efekt wzbudzenia może być równoważny absorpcji fotonu o wysokiej energii o 1/2 długości fali. Na przykład pochłanianie dwóch fotonów o długości fal czerwonych jest równoważne z pochłanianiem przez cząsteczkę ultrafioletu. Fotony o długich falach nie są łatwo absorbowane przez komórki, więc fototoksyczność dla żywych komórek jest zmniejszona, a fotowybielanie jest również ograniczone. W ten sposób nie tylko spełnia funkcję wzbudzania ultrafioletem, ale także zapobiega uszkodzeniu próbki przez światło ultrafioletowe.
3. Co jest szczególnego w laserze mikroskopu dwufotonowego?
Prawdopodobieństwo absorpcji dwufotonowej zależy od tego, jak blisko dwa padające fotony pokrywają się w czasie i przestrzeni (dwa fotony muszą dotrzeć w ciągu 10-18 sekund). Przekrój poprzeczny absorpcji dwufotonowej jest mały i wzbudzane są tylko fluorofory w regionach o dużym strumieniu fotonów. Dlatego większość stosowanych laserów to lasery tytanowo-szafirowe, które mogą osiągać prędkości skanowania pikosekundowe lub femtosekundowe i mają bardzo wysoką moc szczytową i niską moc średnią, dzięki czemu fotowybielanie i fototoksyczność można zmniejszyć lub wyeliminować. Najważniejsze jest zapewnienie bardzo dużej gęstości fotonów w małym zakresie, co może zapewnić jednoczesne wzbudzenie dwóch fotonów.
4. Jakie są zalety wzbudzenia dwufotonowego?
1) Zwiększenie selektywności barwnika: zakres światła wzbudzenia lasera układu konfokalnego (Ar, Ar/Kr, HeNe) wynosi 488nm - 647nm. Oznacza to eksperymentowanie z barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzanymi promieniowaniem UV, np. z DAPI, Hoescht. Długość fali wzbudzenia dwufotonowego jest dwa razy większa niż pojedynczego fotonu, więc barwniki wzbudzone ultrafioletem mogą być wzbudzane światłem bliskiej podczerwieni.
2) Zmniejszenie fotowybielania: Ze względu na zmniejszenie fotowybielania wzrasta wskaźnik powodzenia eksperymentów z wykorzystaniem CFP/YFP do transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET).
3) Nie jest wymagany żaden specjalny obiektyw: Z sprzętowego punktu widzenia, wzbudzenie barwników wzbudzanych promieniowaniem UV za pomocą długości fali bliskiej podczerwieni nie wymaga specjalnych elementów optycznych UV.
4) Popraw stosunek sygnału do szumu: długość fali światła wzbudzenia i długość fali emitowanego światła mają dużą różnicę, co poprawia stosunek sygnału do szumu.
5) Wybielanie zlokalizowane w ognisku: Ponieważ wzbudzenie fluorescencji zachodzi tylko w ognisku obiektywu, nie ma potrzeby stosowania konfokalnego otworka. Poprawia to wykrywanie światła, a fotowybielanie zachodzi tylko w ognisku.
6) Łatwiejsza penetracja próbek: Światło o długości fali podczerwieni nie jest łatwo rozpraszane przez komórki i może penetrować głębsze próbki.
5. Jaka jest największa poprawa w mikroskopii dwufotonowej w porównaniu ze skaningową mikroskopią konfokalną laserową?
1) Zmniejszone fotowybielanie.
2) Zmniejszona fototoksyczność.
3) Nie jest łatwo rozproszyć i łatwiej jest przeniknąć grube próbki, takie jak plastry mózgu.
