Różnica między mikroskopem fluorescencyjnym (dwuphotonem, konfokalnym) i zwykłym mikroskopem
Podstawową zasadą wzbudzenia dwufotonu jest to, że przy wysokiej gęstości fotonu cząsteczki fluorescencyjne mogą jednocześnie wchłaniać dwa fotony długości długości fali i emitować krótszy foton długości fali po krótkim okresie tak zwanego życia stanu wzbudzonego; Efekt jest taki sam, jak przy użyciu fotonu o połowie długości fali długiej długości fali w celu podniecenia cząsteczek fluorescencyjnych. Dwa wzbudzenie fotonów wymaga wysokiej gęstości fotonu, a aby uniknąć uszkodzenia komórek, mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje lasery impulsowe o wysokiej energii. Laser emitowany przez ten laser ma wysoką szczytową energię i niską średnią energię, o szerokości impulsu zaledwie 100 femtosekund i częstotliwości do 80 do 100 megaherc. Podczas stosowania obiektywu obiektywu o wysokiej numerycznej aperturze do skupienia fotonów pulsacyjnego lasera, gęstość fotonu w ogniskowym punkcie obiektywu obiektywnego jest najwyższa, a wzbudzenie dwufotonowe występuje tylko w ogniskowym punkcie obiektywu obiektywnego. Dlatego mikroskop dwufotonowy nie wymaga konfokalnego otworków, co poprawia wydajność wykrywania fluorescencji.
Zasadniczo zjawiska fluorescencyjne, ze względu na niską gęstość fotonu światła wzbudzenia, cząsteczka fluorescencyjna może wchłonąć tylko jeden foton na raz, a następnie emitować kolejne foton fluorescencyjny poprzez przejście promieniujące, które jest znane jako fluorescencja z pojedynczego fotonu. W przypadku procesów wzbudzenia fluorescencji z wykorzystaniem laserów jako źródeł światła mogą wystąpić zjawiska fluorescencyjne dwufotonowe lub nawet wielofotonowe. W takim przypadku zastosowane źródło światła wzbudzenia ma wysoką intensywność i gęstość fotonu, która spełnia wymaganie cząsteczek fluorescencyjnych w celu pochłaniania dwóch fotonów jednocześnie. W procesie stosowania ogólnego lasera jako źródła światła wzbudzenia gęstość fotonu jest nadal niewystarczająca do wytworzenia zjawiska absorpcji dwufotonowej. Zazwyczaj stosuje się lasery pulsu femtosekundowe, a natychmiastowa moc osiąga poziom megawatowy. Dlatego długość fali fluorescencji dwufotonowej jest krótsza niż światło wzbudzenia, równoważne efektowi wytworzonemu przez wzbudzenie długości fali o połowie wzbudzania.
Wiedza związana z konfokalną mikroskopią fluorescencyjną
Podstawową zasadą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej jest użycie źródła światła punktowego do napromieniowania próbki, tworząc dobrze zdefiniowaną małą plamę światła na płaszczyźnie ogniskowej. Fluorescencja emitowana z tego miejsca po napromieniowaniu jest zbierana przez obiektyw obiektywny i wysyłany z powrotem wzdłuż pierwotnej ścieżki napromieniowania do rozdzielacza wiązki złożonego z dichroicznego lustra. Spektrometr wysyła fluorescencję bezpośrednio do detektora. Przed źródłem światła i detektora znajduje się odpowiednio dziurka, zwana odpowiednio otworkiem iluminacją i detekcyjną otworem. Wymiary geometryczne tych dwóch są spójne, w przybliżeniu 100-200 nm; W porównaniu do plamki światła na płaszczyźnie ogniskowej, oba są koniugate, co oznacza, że plamka światła przechodzi przez serię soczewek i może ostatecznie skupić się zarówno na otworach iluminacji, jak i detekcyjnej otworach jednocześnie. W ten sposób światło z płaszczyzny ogniskowej może zbiegać się w zakresie otworu wykrywalnego, podczas gdy rozproszone światło z góry lub poniżej płaszczyzny ogniskowej jest blokowane przed otworem wykrywalnym i nie można go wyobrazić. Skanując punkt próbki po punkcie z laserem, rurka fotomultiplora po wykryciu otworów uzyskuje również odpowiedni konfokalny obraz punktu punktowego światła po punkcie, przekształca go w sygnał cyfrowy i przesyła go na komputer, a ostatecznie agreguje ją w przezroczysty konfokalny obraz całej płaszczyzny ogniskowej na ekranie.
