Główną metodą obserwacyjną mikroskopu optycznego jest obserwacja fluorescencyjna
Zjawisko fluorescencji
Fluorescencja odnosi się do procesu, w którym substancja fluorescencyjna emituje światło o większej długości fali prawie jednocześnie, gdy jest napromieniowana światłem o określonej długości fali (Rysunek 1). Kiedy światło o określonej długości fali (długość fali wzbudzenia) uderza w cząsteczkę (taką jak cząsteczka w fluoroforze), energia fotonu jest absorbowana przez elektrony cząsteczki. Następnie elektrony przechodzą ze stanu podstawowego (S0) na wyższy poziom energetyczny, stan wzbudzony (S1'). Ten proces nazywa się wzbudzeniem①. Elektron pozostaje w stanie wzbudzonym przez 10-9–10-8 sekund, podczas których elektron traci część energii ②. W procesie wychodzenia ze stanu wzbudzonego (S1) i powrotu do stanu podstawowego ③, energia pozostała pochłonięta podczas procesu wzbudzenia zostanie uwolniona.
Czas przebywania cząsteczki fluorescencyjnej w stanie wzbudzonym to czas życia fluorescencji, zwykle w nanosekundach, co jest nieodłączną cechą samej cząsteczki fluorescencyjnej. Technologia obrazowania wykorzystująca czas życia fluorescencji nosi nazwę Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), która oprócz obrazowania intensywności fluorescencji może wykonywać bardziej dogłębne funkcjonalne i dokładne pomiary w celu uzyskania konformacji molekularnej, interakcji międzycząsteczkowych i mikrośrodowisk molekularnych. informacji, które są trudne do uzyskania za pomocą konwencjonalnego obrazowania optycznego.
Inną ważną właściwością fluorescencji jest przesunięcie Stokesa, różnica w długości fali między pikami wzbudzenia i emisji (Rysunek 2). Zwykle długość fali światła emisji jest dłuższa niż długość fali światła wzbudzenia. Dzieje się tak dlatego, że po wzbudzeniu substancji fluorescencyjnej, a przed uwolnieniem fotonu, elektrony stracą część energii w procesie relaksacji. Substancje fluorescencyjne z większymi przesunięciami Stokesa są łatwiejsze do zaobserwowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Mikroskopy fluorescencyjne i bloki filtrów fluorescencyjnych
Mikroskopia fluorescencyjna to mikroskop optyczny, który wykorzystuje właściwości fluorescencyjne do obserwacji i obrazowania i jest szeroko stosowany w biologii komórki, neurobiologii, botanice, mikrobiologii, patologii, genetyce i innych dziedzinach. Obrazowanie fluorescencyjne ma zalety wysokiej czułości i wysokiej specyficzności i jest bardzo odpowiednie do obserwacji rozmieszczenia określonych białek, organelli itp. w tkankach i komórkach, badania kolokalizacji i interakcji oraz śledzenia dynamiki życia procesów, takich jak zmiany stężenia jonów.
Większość cząsteczek w komórkach nie fluoryzuje i aby je zobaczyć, muszą być znakowane fluorescencyjnie. Istnieje wiele metod znakowania fluorescencyjnego, które można znakować bezpośrednio (np. przy użyciu DAPI do znakowania DNA) lub barwienia immunologicznego przy użyciu właściwości przeciwciał wiążących antygen lub białko docelowe można znakować białkami fluorescencyjnymi (takimi jak GFP, zielone białko fluorescencyjne) lub odwracalne wiązanie. barwniki syntetyczne (takie jak Fura-2) itp.
Obecnie mikroskop fluorescencyjny stał się standardowym wyposażeniem różnych laboratoriów i platform obrazowania i jest dobrym pomocnikiem w naszych codziennych eksperymentach. Mikroskopy fluorescencyjne dzielą się głównie na trzy kategorie: pionowe mikroskopy fluorescencyjne (nadające się do cięcia na skrawki), odwrócone mikroskopy fluorescencyjne (odpowiednie do żywych komórek, z uwzględnieniem przekrojów), fluorescencyjne mikroskopy stereoskopowe (odpowiednie do większych okazów, takich jak rośliny, danio pręgowany (dorosły/ zarodek), medaka, narządy myszy/szczura itp.).
Blok filtra fluorescencyjnego jest podstawowym elementem obrazowania fluorescencyjnego w mikroskopach. Składa się z filtra wzbudzenia, filtra emisji i dichroicznego rozdzielacza wiązki. Jest on zainstalowany w kole filtrowym, takim jak Leica DMi8 wyposażony w 6-pozycyjne koło filtrowe (Rysunek 3). ). Różne mikroskopy mają różne pozycje kół, a niektóre mikroskopy używają szkiełek filtracyjnych.
Blok filtra odgrywa ważną rolę w obrazowaniu fluorescencyjnym: filtr wzbudzenia wybiera światło wzbudzające do wzbudzenia próbki i blokuje inne długości fal światła; światło przechodzące przez filtr wzbudzenia przechodzi przez dichroiczny rozdzielacz wiązki (jego rolą jest odbijanie światła wzbudzenia i przepuszczanie fluorescencji), po odbiciu jest skupiane przez soczewkę obiektywu, naświetlane na próbkę, a odpowiednia fluorescencja jest wzbudzana do emitować światło. Emitowane światło jest zbierane przez soczewkę obiektywu, przechodzi przez dichroiczny rozdzielacz wiązki i dociera do filtra emisyjnego. Jak pokazano na rysunku 4: długość fali wzbudzenia wynosi 450-490nm, dichroiczny rozdzielacz wiązki odbija światło krótsze niż 510nm, przepuszcza światło dłuższe niż 510nm, a zasięg emisji światła wynosi 520-560nm.
Filtry fluorescencyjne powszechnie stosowane w mikroskopach fluorescencyjnych można podzielić na dwa rodzaje: filtry długoprzepustowe (w skrócie LP) i pasmowoprzepustowe (w skrócie BP). Przepustowość jest zwykle określana przez centralną długość fali i szerokość przedziału, na przykład 480/40, co oznacza, że światło od 460-500}nm może przejść. Filtry długoprzepustowe, takie jak 515 LP, przepuszczają światło o długości fali większej niż 515 nm (rysunek 5).
Substancje fluorescencyjne mają swoją charakterystyczną krzywą wzbudzenia (absorpcji) i krzywą emisji, szczyt wzbudzenia to idealna długość fali wzbudzenia (wysoka wydajność wzbudzenia, która może zmniejszyć energię światła wzbudzenia, chronić komórki i barwniki), a krzywa emisji to długość fali emisji fluorescencji zasięg. Dlatego w eksperymencie wybierzemy długość fali jak najbliższą szczytowi wzbudzenia dla wzbudzenia, a zakres odbioru musi obejmować szczyt emisji. Na przykład szczyt wzbudzenia Alexa Fluor 488 wynosi 500 nm, a filtr wzbudzenia 480/40 można wybrać w mikroskopie fluorescencyjnym.
Szczegóły dotyczące kostek filtrów można wyświetlić w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopu. Zrozumienie barwników i znalezienie filtra, który najlepiej pasuje do próbki, ma kluczowe znaczenie dla obrazowania fluorescencyjnego. Informacje spektralne barwników fluorescencyjnych i białek fluorescencyjnych są ogólnie wskazane w instrukcjach i można je również znaleźć w Internecie.
Oprócz długości fal wzbudzenia i emisji sond fluorescencyjnych, przy wyborze bloków filtrów należy również wziąć pod uwagę, czy występuje niespecyficzne wzbudzenie i czy występuje kolor krzyżowy dla próbek oznaczonych wielokolorowo. Ponadto należy wziąć pod uwagę zastosowane źródło światła fluorescencyjnego. Obecnie powszechnie stosowane fluorescencyjne źródła światła obejmują lampy rtęciowe, lampy metalohalogenkowe i źródła światła LED, które w ostatnich latach szybko się rozwinęły. Widmo fluorescencyjnego źródła światła jest ciągłe lub nieciągłe, a energia będzie różna w różnych pasmach długości fal. Źródło światła LED stopniowo staje się głównym źródłem światła mikroskopu fluorescencyjnego ze względu na stosunkowo wąskie pasmo widmowe, bardziej stabilną moc wyjściową, długą żywotność, bezpieczeństwo i ochronę środowiska oraz wiele innych zalet.
Oprócz wbudowanego bloku filtrów w mikroskopie znajduje się również zewnętrzne szybkie koło (Rysunek 7). Szybkość konwersji filtra przylegającego do zewnętrznego szybkiego koła Leiki wynosi 27 ms, co pozwala na realizację szybkich eksperymentów wielokolorowych, takich jak obrazowanie wapnia w proporcjach FRET i Fura2. (ryc. 8) i in.
Szeroka gama technik obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej
Aby sprostać różnym potrzebom w zakresie obrazowania fluorescencyjnego, oprócz mikroskopów fluorescencyjnych opracowano różne rozwiązania do obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej:
Szerokokątne systemy obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak Leica THUNDER Imager, wykorzystują innowacyjną technologię Clearing firmy Leica do skutecznego usuwania sygnałów interferencyjnych z płaszczyzny nieogniskowej podczas obrazowania, prezentując wyraźne obrazy i zalety szybkiego obrazowania;
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wykorzystuje otworki w celu wyeliminowania interferencji w płaszczyźnie nieogniskowej, realizuje przekroje optyczne i uzyskuje obrazy o wysokiej rozdzielczości i obrazy trójwymiarowe;
Mikroskopy i nanomikroskopy o bardzo wysokiej rozdzielczości, które przekraczają granicę dyfrakcji, mogą obserwować drobne struktury mniejsze niż 200 nm;
System obrazowania wielofotonowego wykorzystujący zasadę wzbudzenia wielofotonowego do obrazowania tkanki grubej i głębokiej in vivo;
Technologia obrazowania arkuszy świetlnych o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, dużej szybkości obrazowania, wysokiej rozdzielczości, niskiej fototoksyczności, szczególnie odpowiednia do badań nad rozwojem i dynamiczną obserwacją in vivo;
Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), na które nie mają wpływu takie czynniki, jak stężenie substancji fluorescencyjnej, fotowybielanie, intensywność światła wzbudzenia itp., Może wykonywać bardziej dogłębne funkcjonalne i dokładne pomiary;
Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) i spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) mierzą liczbę cząsteczkową i współczynnik dyfuzji cząsteczek fluorescencyjnych, analizując w ten sposób stężenie cząsteczkowe, wielkość cząsteczkową, lepkość, ruch cząsteczkowy, wiązanie / dysocjację cząsteczkową i właściwości optyczne molekularne;
Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) o wyjątkowo wysokiej rozdzielczości w osi Z jest idealna do badania struktury molekularnej i dynamiki powierzchni błon komórkowych.
